X Fragile-Immagine Credit Public Domain-
Una terapia antisenso sviluppata da Joel D. Richter, Ph.D., Sneha Shah, Ph.D e Jonathan K. Watts, Ph.D., della UMass Chan Medical School ed Elizabeth Berry-Kravis, MD, Ph.D. .e del RUSH University Medical Center, ripristina la produzione della proteina FMRP in campioni cellulari prelevati da pazienti con sindrome dell’X fragile.
Pubblicato negli Atti della National Academy of Sciences, questa svolta è stata possibile grazie alle nuove scoperte, presentate anche nello studio, secondo cui lo splicing alternativo aberrante dell’RNA messaggero (mRNA) svolge un ruolo principale nella sindrome dell’X fragile, la forma più comune di disabilità intellettiva ereditaria e la più frequente causa monogenica di autismo.
“Questa scoperta offre una reale speranza che una terapia che mitiga la sindrome dell’X fragile possa essere possibile e possa essere tradotta in clinica prima di quanto pensassimo una volta”, ha affermato il Dottor Richter, Arthur F. Koskinas Chair in Neuroscience e Professore di medicina molecolare. “Questi risultati non sono convenzionali e non erano qualcosa che ci aspettavamo. Se fai una buona scienza di base, credi nei tuoi dati e segui dove ti portano, i risultati possono cambiare la nostra comprensione fondamentale della biologia e delle malattie“.
La sindrome dell’X fragile è una condizione genetica risultante da un’espansione della ripetizione CGG nella sequenza del DNA del gene dell’X fragile (FMR1). Le persone con l’X fragile soffrono di disabilità intellettiva e di problemi comportamentali e di apprendimento. Le disabilità cognitive possono variare da lievi a gravi e affliggono i ragazzi più frequentemente delle ragazze.
Non esiste una cura per la sindrome dell’X fragile, anche se interventi come l’educazione speciale, la logopedia, la terapia fisica o comportamentale e i farmaci che forniscono sollievo sintomatico possono fornire l’opportunità di ottimizzare una gamma completa di abilità.
Se osservato al microscopio, il gene FMR1 contenente l’espansione ripetuta viene rilevato come una banda ristretta che pizzica la punta di un braccio del cromosoma X (identificato come il sito fragile). La funzione principale del prodotto proteico del gene FMR1 (FMRP) è quella di legare fino a 1.000 diversi mRNA e inibirne la traduzione.
Quando FMRP è assente, come nella sindrome dell’X fragile, c’è un eccesso di produzione di centinaia di diverse proteine nel cervello. Sebbene non sia del tutto chiaro come, il controllo FMRP della traduzione dell’mRNA svolge un ruolo fondamentale nella plasticità sinaptica e nella funzione cerebrale superiore. Senza FMRP, il normale sviluppo neurologico non si verifica.
Normalmente, gli esseri umani hanno tra cinque e 55 ripetizioni CGG nel gene FMR1. La sindrome dell’X fragile si verifica quando un individuo ha più di 200 ripetizioni CGG nella sequenza del gene FMR1. Il modello convenzionale della malattia sostiene che una volta che una lunghezza di ripetizione CGG raggiunge 200 o più, il gene viene metilato e spento e non produce RNA FMR1 o FMRP.
Utilizzando campioni di sangue di maschi con X fragile forniti dal Dr. Berry-Kravis, Professore di pediatria, scienze neurologiche e anatomia e biologia cellulare, i Drs. Richter e Shah hanno trovato qualcosa di inaspettato.
“Avevamo motivo di credere che ci fossero difetti in un certo numero di mRNA prodotti da pazienti X fragili“, ha detto il Dottor Shah, assistente Professore di medicina molecolare. “Abbiamo eseguito gli esperimenti e iniziato a esaminare le varie letture dell’RNA, tuttavia, siamo rimasti sorpresi nello scoprire che le cellule stavano producendo fragile X mRNA anche se non veniva prodotta alcuna proteina. Non avrebbero dovuto produrre alcun fragile X mRNA. Questo non doveva accadere. Ci ha fatto ripensare al modo in cui la malattia si stava verificando a livello biologico di base“.
Osservando da vicino l’mRNA dell’X fragile che porta la mutazione, Shah ha trovato un’isoforma di giunzione anormale poco conosciuta, una variazione di sequenza, denominata FMR1-217. Prima che l’mRNA possa essere tradotto dal ribosoma in una proteina funzionante, subisce un processo chiamato splicing.
Questo processo intermedio rimuove tutte le regioni non codificanti dell’RNA (introni) e ricompone le regioni codificanti delle proteine (esoni). Si ritiene che le variazioni in questo meccanismo di splicing, chiamato splicing alternativo, consentano a un singolo gene di creare diverse isoforme di RNA. Queste isoforme, poiché contengono ciascuna regioni codificanti diverse, consentono a un singolo gene di produrre più proteine.
Le ripetizioni CGG trovate nella mutazione del gene FMR1, tuttavia, stavano causando un evento di splicing errato che lasciava un pezzo cruciale di un introne (uno pseudo-esone) nell’mRNA maturo. Questo semplice errore di splicing era il motivo per cui non veniva prodotto l’FMRP, non la metilazione del gene, come si credeva in precedenza. Richter e Shah hanno ipotizzato che se questo errore di splicing potesse essere corretto o evitato, allora la normale produzione di proteine X fragili potrebbe essere ripristinata.
Un modo per alterare lo splicing dell’RNA è creare un oligonucleotide antisenso (ASO), un breve pezzo di DNA con una sequenza complementare, che si legherà all’mRNA bersaglio. Questo legame fa sì che il macchinario di splicing salti i siti di splicing impropri sull’RNA, determinando splicing normale e formazione di mRNA maturo. È anche una tecnica che è già impiegata in clinica per trattare l’atrofia muscolare spinale (SMA) del disturbo neuromuscolare ed è in sperimentazione clinica per altre malattie neurologiche.
Per progettare un ASO mirato all’mRNA dell’X fragile, Richter e colleghi si sono rivolti al Dottor Watts, un esperto di ASO che lavora anche su malattie neurologiche come la malattia di Huntington e la SLA. Watts, Professore di terapia dell’RNA, ha progettato 11 ASO nel tentativo di trovarne uno che bloccasse lo splicing errato del fragile X RNA e ripristinasse la produzione di FMRP.
Una combinazione di due ASO sviluppati da Watts ha inibito con successo lo splicing aberrante e salvato il corretto splicing dell’mRNA di FMR1 nelle cellule derivate dal paziente. Ciò ha portato alla produzione di livelli normali di FMRP in queste cellule.
“Non l’avremmo mai trovato usando un modello murino di fragile X“, ha detto Richter. “Il modello murino è un knockout genetico. Poiché semplicemente non ha il gene X fragile, non viene prodotto alcun mRNA. Il mis-splicing dell’mRNA di FMR1 è un meccanismo di regolazione genica che dipende dall’espansione del CGG, che può essere unico per l’uomo e i primati. Abbiamo scoperto questo errore di giunzione solo perché stavamo lavorando su cellule umane“.
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Richter e colleghi sperano che il trasferimento di questa scoperta alla clinica possa essere accelerato perché gli attuali trattamenti per la SMA si basano su una tecnologia simile. L’unica differenza tra i due è la sequenza genetica dell’ASO utilizzata per trattare il fragile X errato splicing.
“Questa è una scoperta molto eccitante che ha un alto potenziale terapeutico”, ha detto Berry-Kravis.
“È molto presto per lo sviluppo, tuttavia, ed è necessario molto lavoro per determinare quanto efficacemente la strategia ASO possa ripristinare FMRP, in quale percentuale di cellule cerebrali e in quali individui con X fragile. Se la strategia ASO risulta avere successo in cellule di una percentuale significativa di individui con X fragile, ciò potrebbe fornire un’inversione genetica della malattia che potrebbe avere un elevato impatto clinico e migliorare il livello funzionale delle persone che vivono con X fragile e ridurre il carico sui loro caregiver”.
Fonte: PNAS
