Editing del genoma-Immagine Credit Public Domain.
Ricercatori guidati dall’Università di Osaka hanno sviluppato una nuova tecnica di modifica genetica nota come NICER che riduce significativamente le mutazioni fuori bersaglio nel DNA.
La tecnica di editing genetico CRISPR/Cas9 ha consentito ai ricercatori di apportare modifiche precise e di grande impatto al DNA di un organismo per correggere le mutazioni che causano malattie genetiche. Tuttavia, il metodo CRISPR/Cas9 può anche provocare mutazioni involontarie del DNA che potrebbero avere effetti negativi. Recentemente, ricercatori in Giappone hanno sviluppato una nuova tecnica di editing genetico che è efficace quanto CRISPR/Cas9 riducendo significativamente queste mutazioni involontarie.
Mutazioni fuori bersaglio risultanti dai metodi convenzionali di modifica del genoma. A causa della natura mutagena della riparazione della rottura del doppio filamento del DNA, anche se la mutazione genetica viene corretta con successo, esiste un rischio maggiore di mutazioni fuori bersaglio in aree distinte dal bersaglio originale di CRISPR/Cas9. Credito: S. Nakada
Comprendere la metodologia NICER
Nel nuovo studio pubblicato sulla rivista Nature Communications, i ricercatori guidati dall’Università di Osaka hanno introdotto una nuova tecnica chiamata NICER, che si basa su la creazione di piccoli tagli multipli nei singoli filamenti di DNA da parte di un enzima chiamato nickasi.
L’editing tradizionale CRISPR/Cas9 utilizza piccoli pezzi di codice genetico chiamati RNA guida e un enzima chiamato Cas9. Gli RNA guida prendono di mira una sezione specifica del DNA e l’enzima Cas9 avvia una rottura nella struttura del DNA a doppio filamento in questa posizione. Questa rottura del doppio filamento è la chiave per avviare cambiamenti nel DNA. “Tuttavia, la riparazione cellulare delle rotture del doppio filamento può portare a mutazioni involontarie del DNA, nonché all’integrazione del DNA esogeno nel genoma umano, il che solleva problemi di sicurezza per le applicazioni cliniche della tecnologia CRISPR/Cas9″, spiegano gli autori. Per ridurre al minimo queste mutazioni involontarie, il gruppo di ricerca guidato dall’Università di Osaka ha studiato l’uso della nickasi Cas9, che crea rotture a filamento singolo o “intaccature” nel DNA che vengono generalmente riparate senza causare mutazioni.
Vantaggi e applicazioni di NICER
Modifica del genoma utilizzando il mutante Cas9, nickase. La nickasi induce rotture del singolo filamento (intaccature) invece delle rotture del doppio filamento del DNA. Le tacche vengono generalmente riparate senza causare mutazioni. Pertanto, anche se le intaccature compaiono in siti diversi dal bersaglio originale della nickasi, raramente si osservano nuove mutazioni genetiche in queste posizioni. Questo approccio consente una correzione genetica precisa con mutazioni minime fuori bersaglio. Credito: S. Nakada
“Ogni cromosoma del genoma ha una copia ‘omologa’”, afferma l’autore principale dello studio Akiko Tomita. “Utilizzando la tecnica NICER, le mutazioni eterozigoti – in cui una mutazione appare in un cromosoma, ma non nella sua copia omologa – vengono riparate utilizzando il cromosoma omologo non mutato come modello”.
Per i loro esperimenti iniziali, il gruppo di ricerca ha utilizzato cellule linfoblastiche umane con una mutazione eterozigote nota in un gene chiamato TK1. “Quando queste cellule sono state trattate con nickasi per indurre un singolo taglio nella regione TK1, l’attività di TK1 è stata recuperata a un ritmo basso. Tuttavia, quando la nickasi ha indotto più incisioni in questa regione su entrambi i cromosomi omologhi, l’efficienza della correzione genetica è stata aumentata di circa diciassette volte attraverso l’attivazione di un meccanismo di riparazione cellulare”, spiegano gli autori.
Schema del metodo di modifica genetica NICER. Viene creato un graffio vicino alla mutazione (ed è esclusivo dell’allele mutante). La semplice introduzione di un’incisione vicino alla mutazione provoca la ricombinazione omologa tra cromosomi omologhi, ma a un tasso molto basso. Tuttavia, quando vengono apportate una o due incisioni aggiuntive a entrambi gli alleli, l’efficienza della correzione genetica attraverso la ricombinazione omologa interomologa vede un aumento significativo. Credito: S. Nakada
“Ulteriori analisi genomiche hanno mostrato che la tecnica NICER raramente induce mutazioni fuori bersaglio”, afferma l’autore senior Shinichiro Nakada. “Siamo stati inoltre lieti di scoprire che NICER è stato in grado di ripristinare l’espressione dei geni patogeni nelle cellule derivate da malattie genetiche che comportano mutazioni eterozigoti composte”.
Leggi anche:CRISPR-Cas9: emergono potenziali insidie nell’uso
Poiché il metodo NICER non prevede rotture del doppio filamento del DNA o l’uso di DNA esogeno, questa tecnica sembra essere un’alternativa sicura ai metodi convenzionali CRISPR/Cas9. NICER potrebbe rappresentare un nuovo approccio per il trattamento delle malattie genetiche causate da mutazioni eterozigoti.
