SPLICER-Immagine Credit Public Domain.
“Un nuovo strumento di editing genetico denominato SPLICER, che aiuta i meccanismi cellulari a saltare parti di geni responsabili delle malattie, è stato applicato per ridurre la formazione di precursori della placca beta-amiloide in un modello murino di Alzheimer”, riferiscono i ricercatori dell’Università dell’Illinois a Urbana-Champaign.
“L’applicazione su topi vivi mostra l’efficienza migliorata dello strumento SPLICER, rispetto allo standard attuale nella tecnologia di editing genetico, nonché il potenziale per l’applicazione in altre malattie”, hanno affermato i ricercatori. Guidati da Pablo Perez-Pinera, Professore di bioingegneria presso l’U. of I., i ricercatori hanno pubblicato le loro scoperte sulla rivista Nature Communications.
SPLICER utilizza un approccio di editing genetico chiamato “esone skipping”, che risulta di particolare interesse per le condizioni di salute causate da mutazioni che producono proteine mal ripiegate o tossiche, come la distrofia muscolare di Duchenne o la malattia di Huntington.
“Il DNA contiene le istruzioni per costruire tutto ciò che è responsabile del funzionamento delle cellule. Quindi è come un libro di ricette che contiene istruzioni molto dettagliate per cucinare”, ha detto Perez-Pinera. “Ma ci sono grandi regioni di DNA che non codificano nulla. È come se iniziassi la ricetta per una cena a base di tacchino e poi ti imbatti in una nota che dice “continua a pagina 10”. Dopo pagina 10, c’è “continua a pagina 25”. Le pagine in mezzo sono incomprensibili“, spiega Pablo Perez-Pinera, Professore di Bioingegneria, Università dell’Illinois a Urbana-Champaign.
“Ma diciamo che in una delle pagine delle ricette, in genetica un esone, c’è un errore di battitura che rende il tacchino immangiabile o addirittura velenoso. Se non possiamo correggere direttamente l’errore di battitura, potremmo modificare la nota prima di essa per inviarti alla pagina successiva, saltando la pagina con l’errore, così che alla fine potresti preparare un tacchino commestibile. Anche se potresti perdere il sugo che era sulla pagina saltata, avresti comunque cenato. Allo stesso modo, se possiamo saltare il pezzo del gene con la mutazione tossica, la proteina risultante potrebbe ancora avere abbastanza funzione per svolgere i suoi ruoli critici“.
SPLICER si basa sulla popolare piattaforma di editing genetico CRISPR-Cas9, con modifiche chiave. I sistemi CRISPR-Cas9 richiedono una sequenza di DNA specifica per agganciarsi, limitando i geni che potrebbero essere modificati. SPLICER utilizza enzimi Cas9 più recenti che non necessitano di quella sequenza, aprendo la porta a nuovi target come il gene correlato all’Alzheimer su cui si è concentrato il gruppo dell’Illinois.
“Un altro problema che affrontiamo nel nostro lavoro è la precisione in ciò che viene saltato”, ha affermato Angelo Miskalis, uno dei primi autori del documento. “Con le attuali tecniche di salto degli esoni, a volte non tutto l’esone viene saltato, quindi c’è ancora una parte della sequenza che non vogliamo venga espressa. Nell’analogia del libro di cucina, è come cercare di saltare una pagina, ma la nuova pagina inizia nel mezzo di una frase e ora la ricetta non ha senso. Volevamo impedirlo“.
Ci sono due aree di sequenza chiave che circondano un esone che indicano al macchinario cellulare quali parti di un gene usare per creare proteine: una all’inizio e una alla fine. Mentre la maggior parte degli strumenti di salto degli esoni mirano a una sola sequenza, SPLICER modifica sia la sequenza iniziale che quella finale. “Di conseguenza, gli esoni mirati vengono saltati in modo più efficiente”, ha affermato Miskalis.
Il gruppo dell’Illinois ha scelto di prendere di mira un gene dell’Alzheimer per la prima dimostrazione delle capacità terapeutiche di SPLICER perché, mentre il gene bersaglio è stato ampiamente studiato, l’efficace salto dell’esone è rimasto elusivo negli organismi viventi. I ricercatori hanno preso di mira un esone specifico che codifica per una sequenza di amminoacidi all’interno di una proteina che viene scissa per formare beta-amiloide, che si accumula per formare placche sui neuroni nel cervello man mano che la malattia progredisce.
Nei neuroni coltivati, SPLICER ha ridotto in modo efficiente la formazione di beta-amiloide. Analizzando l’output di DNA e RNA dei cervelli dei topi, i ricercatori hanno scoperto che l’esone mirato era diminuito del 25% nei topi trattati con SPLICER, senza alcuna prova di effetti off-target.
“Quando abbiamo provato originariamente a colpire questo esone con tecniche più vecchie, non ha funzionato”, ha detto la studentessa laureata Shraddha Shirguppe, anche lei co-prima autrice dello studio. “Combinando i più recenti editor di base con l’editing a doppio splice, l’esone è saltato a una velocità molto migliore di quanto fossimo in grado di fare in precedenza con uno qualsiasi dei metodi disponibili. Siamo stati in grado di dimostrare che non solo poteva saltare meglio l’intero esone, ma riduceva anche la proteina che produce la placca in queste cellule“.
“L’esone saltato funziona solo se la proteina risultante è ancora funzionale, quindi non può curare ogni malattia con una base genetica. Questa è la limitazione generale dell’approccio“, ha detto Perez-Pinera. “Ma per malattie come l’Alzheimer, il Parkinson, l’Huntington o la distrofia muscolare di Duchenne, questo approccio ha molto potenziale. Il passo successivo immediato è esaminare la sicurezza della rimozione degli esoni mirati in queste malattie e assicurarci di non creare una nuova proteina tossica o priva di una funzione chiave. Dovremmo anche fare studi sugli animali a lungo termine e vedere se la malattia progredisce nel tempo“.
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In Illinois, Perez-Pinera è anche affiliato al dipartimento di Fisiologia molecolare e integrativa, al Carle Illinois College of Medicine, al Cancer Center at Illinois e al Carl R. Woese Institute for Genomic Biology. I Professori di bioingegneria dell’U. of I. Sergei Maslov e Thomas Gaj sono stati coautori del documento. I National Institutes of Health, la Muscular Dystrophy Association, l’American Heart Association, la Parkinson’s Disease Foundation e la Simons Foundation, hanno supportato questo lavoro.
Fonte:Nature Communications
