Immagine: Public Domain.
L’identificazione rapida e affidabile di un’infezione virale sconosciuta è una sfida. L’uso della tecnologia CRISPR può rilevare simultaneamente acidi nucleici di molti virus e individuarne di specifici, come il virus SARS-CoV-2 che causa COVID-19.
Gli attuali gravi effetti della pandemia globale di COVID-19 rivelano la nostra vulnerabilità alle malattie infettive emergenti e sottolinea inoltre la necessità di strumenti per rilevare un’ampia gamma di agenti patogeni, noti e recentemente emersi, che potrebbero minacciare la salute pubblica. Tuttavia, la diversità genetica dei potenziali autori, che includono virus, batteri, funghi e protozoi, rappresenta una difficoltà pratica. I metodi molecolari che rilevano gli acidi nucleici si adattano in modo univoco a questo compito poiché tali agenti infettivi contengono DNA, RNA o entrambi, che ne consente il riconoscimento e l’identificazione. I metodi di sorveglianza fattibili per rintracciare le infezioni globali emergenti devono avere un’ampia capacità di rilevamento, essere adatti all’uso ad alta velocità e avere bassi costi per i test. Uno studio di Ackerman della University of Calgary e colleghi, pubblicato su Nature, descrive un tentativo di soddisfare questi requisiti usando una piattaforma di rilevazione diagnostica da loro creata, chiamata CARMEN (reazioni combinate combinate per la valutazione multiplata degli acidi nucleici).
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CARMEN è un’estensione di SHERLOCK, una piattaforma diagnostica precedentemente sviluppata da alcuni membri dello stesso team che è stata costruita attorno allo strumento di biotecnologia CRISPR, che può essere utilizzata per modificare selettivamente gli acidi nucleici. CRISPR si basa su un sistema di difesa batterica. Il suo utilizzo come strumento di laboratorio dipende da un RNA “guida” (chiamato anche RNA CRISPR) presente in un complesso con un enzima Cas. Se l’RNA guida si lega a un bersaglio di acido nucleico che è complementare ad esso in sequenza, Cas viene attivato e scinde il bersaglio. Alcune proteine Cas tagliano gli acidi nucleici target solo in un sito specifico correlato alla sequenza guida.
Tuttavia, Cas13 è diverso dalle altre proteine Cas in quanto digerisce solo RNA e non DNA ed esercita la sua attività di scissione dell’RNA su qualsiasi RNA vicino che incontra. Questa proprietà può essere utilizzata per generare un segnale che indica la presenza di una sequenza di interesse. Questo principio è alla base di SHERLOCK e CARMEN.
Un RNA viene suddiviso in modo non specifico per sequenza da Cas13 se viene attivato attraverso il riconoscimento di una sequenza specifica. Questa scissione genera un segnale fluorescente separando due componenti collegati all’RNA reporter: un estinguente a fluorescenza e una molecola fluorescente (Fig. 1). CARMEN mantiene la rilevazione sensibile e specifica ottenuta da SHERLOCK e aggiunge la capacità di rilevazione simultanea di bersagli multipli di acido nucleico. Ciò rende il flusso di lavoro compatibile con un’impostazione miniaturizzata ad alta produttività che consente tempi di risposta rapidi a un basso costo per il test.
Immagine: Figure 1 | A method to detect viral infection. Ackerman et al.3
Per rilevare specifici acidi nucleici mediante CARMEN, il processo inizia con l’amplificazione degli acidi nucleici virali target (se presenti) in un campione mediante metodi come la reazione a catena della polimerasi (PCR) o la reazione della ricombinasi polimerasi (RPA). L’acido nucleico amplificato può essere il prodotto di una specifica reazione di amplificazione che prende di mira una singola sequenza virale, oppure può essere il prodotto di reazioni aggregate utilizzate per amplificare potenzialmente un intervallo di diverse sequenze virali. Al campione di RNA amplificato viene assegnato un codice colore unico mediante l’uso di quattro coloranti fluorescenti miscelati in un rapporto che fornisce una delle 1.050 possibili combinazioni di colori. Viene quindi aggiunto olio per generare goccioline emulsionate da un nanolitro. Gli autori hanno preparato tali goccioline per tutte le diverse reazioni di amplificazione effettuate. Hanno anche generato una serie di goccioline emulsionate con codici colore univoci contenenti i componenti necessari per rilevare la presenza di specifiche sequenze virali. Ogni miscela di rilevamento comprendeva un reporter marcato in modo fluorescente RNA e Cas13 legati a un RNA guida necessario per rilevare un bersaglio virale.
Tutte le goccioline emulsionate vengono miscelate in un unico tubo e il suo contenuto viene caricato su un chip contenente micropozzetti che ospitano solo due goccioline. Le goccioline si distribuiscono casualmente nei micropozzetti, per costituire ciò a cui gli autori si riferiscono come un array autoassemblante, in modo tale che ogni target di acido nucleico amplificato dovrebbe essere esposto a ciascun mix di rilevazione, in più replicati in diverse posizioni sul chip. Il punto esatto in cui ciò accade viene rivelato registrando i due codici colore presenti in ciascun pozzetto. Le reazioni di rilevazione vengono quindi avviate simultaneamente in ciascun pozzetto unendo le coppie di goccioline per esposizione a un campo elettrico. Se una sequenza virale amplificata si trova in un pozzo che contiene Cas13 in complesso con un RNA guida in grado di riconoscere questa sequenza, Cas13 viene attivato e la sua attività non specifica di scissione dell’RNA genera un segnale fluorescente dall’RNA giornalista. Questa piattaforma è ammirevolmente innovativa, coniugando le caratteristiche desiderabili della capacità del complesso guida RNA – Cas13 di riconoscere una sequenza specifica con una piattaforma salva-lavoro intrinsecamente flessibile perché l’utente può selezionare le reazioni PCR e le sequenze guida-RNA utilizzate .
Dalle forbici CRISPR ai sensori di virus
Per illustrare la potenziale applicazione di CARMEN per ampi test su campioni di virus, gli autori mostrano che la tecnica poteva rilevare simultaneamente tutti i 169 virus umani per i quali erano disponibili almeno 10 sequenze di genomi al momento. Gli autori dimostrano anche che CARMEN consente l’identificazione completa di diversi ceppi di influenza da campioni ottenuti da persone infette. Questo è importante perché potrebbe consentire il rilevamento di un nuovo tipo di influenza emergente. CARMEN può essere adattato per rilevare una variante virale risultante da una mutazione dopo che è stata determinata la sequenza della variante. Ackerman e colleghi riferiscono che, quando CARMEN è stato utilizzato su campioni di persone infette da HIV, è stato in grado di rilevare sei mutazioni virali note associate alla resistenza ai farmaci.
Infine, gli autori illustrano la flessibilità di CARMEN adattando rapidamente il sistema per rilevare SARS-CoV-2, il coronavirus che causa COVID-19. Gli autori riportano che CARMEN distingue SARS-CoV-2 dagli altri coronavirus umani, inclusi quattro coronavirus stagionali e i coronavirus responsabili, rispettivamente, della sindrome respiratoria acuta grave (SARS) e della sindrome respiratoria del Medio Oriente (MERS). Recentemente è stato segnalato un rilevamento rapido, sensibile e specifico di SARS-CoV-2 mediante un metodo che utilizza CRISPR e Cas126, e tale tecnica ha somiglianze con CARMEN, ma è possibile rilevare solo un tipo di virus.
Fonte: Nature