Per decenni, gli scienziati dell’ Università di Harvard hanno visto il cervello come una vera e propria scatola nera e ora Catherine Dulac e Xiaowei Zhuang, sono pronti ad aprirla.
Dulac, Professore di biologia molecolare e cellulare e Zhuang, Professore di scienze, sono gli autori senior di un nuovo studio che ha creato il primo atlante cellulare di una regione importante nel cervello dei topi.
Utilizzando una tecnologia di imaging all’avanguardia, Dulac, Zhuang e colleghi hanno esaminato oltre 1 milione di cellule in 2 millimetri per 2 millimetrI per blocco di 0,6 millimetri di cervello e non solo hanno identificato più di 70 diversi tipi di neuroni, ma hanno anche individuato dove si trovavano le cellule e le loro varie funzioni.
Lo studio è descritto in un articolo pubblicato il 1 novembre su Science.
“Questo studio ci dà una visione granulare dell’organizzazione cellulare, molecolare e funzionale del cervello“, ha detto Dulac. “Questo lavoro in sé è un passo avanti perché ora comprendiamo diversi comportamenti come non li abbiamo compresi prima, ma è un passo avanti anche perché questa tecnologia può essere utilizzata ovunque nel cervello per qualsiasi tipo di funzione“.
Lo studio è nato dal desiderio di affrontare ciò che Dulac ha definito un problema biologico fondamentale e una sfida tecnologica che ne deriva.
“Il problema è che i ricercatori non si sono resi conto molto tempo fa che, per studiare il cervello, è necessario capire i suoi componenti e quei componenti sono le cellule”, ha detto Dulac. “Quindi se prendi un pezzo di tessuto e guardi i geni espressi dalle cellule, questo ti dice quanti tipi di cellule ci sono … ma ti lascia ancora un grosso problema da risolvere, e questo problema è che tali tecniche richiedono ai ricercatori di dissociare le cellule dal tessuto e, nel processo, si perde un’ informazione preziosa: come le cellule erano organizzate nel tessuto. Se vuoi veramente capire il cervello, hai bisogno del contesto spaziale, perché il cervello non è come il fegato o altri organi, dove le cellule sono organizzate in modo simmetrico. Il cervello è insolito in quanto ha questa disposizione topologica dei neuroni ... quindi vogliamo essere in grado di guardare una sezione del cervello e vedere quali cellule ci sono, ma anche dove sono e quali tipi di cellule stanno circondando i neuroni’.
Fortunatamente il laboratorio di Zhuang negli ultimi anni ha sviluppato lo strumento perfetto per il lavoro: l’ibridazione in situ di errore multiplexed-Robust in fluorescenza o in breve MERFISH.
Dopo lo sviluppo di STORM, una tecnica di imaging super-risoluzione che ha permesso ai ricercatori di catturare singole molecole con una risoluzione su scala nanometrica, Zhuang ha posto l’attenzione sull’imaging non solo di singoli tipi di molecole, ma di tutte le molecole al lavoro nella cellula.
“Non abbiamo solo uno o due diversi tipi di molecole nelle nostre cellule, abbiamo migliaia e decine di migliaia di geni che sono espressi per rprodurre le macchine molecolari che danno alle cellule la loro funzione“, ha dettoZhuang. “Volevo essere in grado di visualizzare tutti quei geni contemporaneamente, ecco perché abbiamo sviluppato MERFISH”.
Il metodo MERFISH funziona assegnando “codici a barre” agli RNA della cellula e quindi, leggendo quei codici a barre mediante imaging si può determinare l’identità delle singole molecole di RNA. Numerosi codici a barre diversi vengono letti contemporaneamente attraverso più cicli di imaging.
“Una proprietà sorprendente di questo metodo è il ridimensionamento esponenziale tra il numero di geni che possono essere ripresi e il numero di cicli di imaging“, ha detto il ricercatore. ” L’approccio MERFISH è molto potente perché ci permette di visualizzare e distinguere migliaia di diversi RNA in soli circa 10 cicli di imaging“.
Zhuang e colleghi hanno creato un metodo di correzione degli errori in MERFISH per garantire che i codici a barre vengano letti correttamente. Anziché utilizzare tutti i codici a barre possibili, in cui un singolo errore potrebbe causare la lettura errata di un codice come un altro codice valido, il team seleziona un sottoinsieme di codici a barre che può essere letto erroneamente solo se si verificano simultaneamente più errori, riducendo drasticamente la possibilità di identificare erroneamente un gene.
“Una delle principali applicazioni che abbiamo inventato in MERFISH è quella di identificare i tipi di cellule in situ perché diversi tipi di cellule hanno diversi profili di espressione genica, quindi questi profili di espressione genica forniscono un modo quantitativo e sistematico per l’identificazione del tipo di cellula“, ha spiegato Zhuang. “E poiché possiamo farlo nei tessuti intatti con l’imaging MERFISH, possiamo fornire anche l’organizzazione spaziale di questi tipi di cellule“.
Armati di MERFISH, Dulac, Zhuang e colleghi hanno deciso di affrontare le questioni biologiche fondamentali che hanno a lungo tormentato gli scienziati nel tentativo di capire come funziona il cervello.
“Ci sono aree nel cervello che sono state studiate, come la corteccia, dove li ricercatori hanno notato che le cellule erano organizzate in un modo particolare, ma ci sono molte aree del cervello per le quali non conosciamo i principi dell’organizzazione”, Dulac aggiunge. “L’area che abbiamo esaminato in questo studio, l’ipotalamo, è assolutamente essenziale per molte funzioni … controlla cose come sete, alimentazione, sonno e comportamenti sociali come genitorialità e riproduzione, ma non sappiamo come questa struttura sia organizzata’.
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Per svelare questo mistero, Dulac e Zhuang hanno combinato MERFISH con un altro metodo chiamato sequenziamento di RNA a singola cellula, che consente una quantificazione imparziale dei profili di espressione genica delle cellule.
“Questo non solo ha permesso di catalogare i tipi di cellule nell’ipotalamo, ma ha anche fornito le firme molecolari di questi tipi di cellule e ha facilitato la selezione di pannelli genetici per l’imaging MERFISH“, ha detto Zhuang.
Basandosi su queste firme molecolari e su altri geni di importanza funzionale, i ricercatori hanno usato MERFISH per simulare simultaneamente più di 150 geni in tutta la regione preottica dell’ipotalamo per identificare i tipi di cellule in situ e creare una mappa spaziale di dove fossero localizzate quelle cellule.
“Sia scRNAseq che MERFISH ci hanno permesso di identificare circa 70 diversi sottotipi neuronali, la maggior parte dei quali precedentemente sconosciuti” ha detto Zhuang, “e l’imaging MERFISH ci ha permesso di vedere anche le distribuzioni spaziali di tutti i 70 tipi neuronali, nonché quelle dei tipi di cellule non neuronali’.
“Quello che puoi vedere è che c’è una squisita organizzazione spaziale “, ha detto Zhuang. “Puoi vedere quali neuroni sono vicini l’un l’altro … e non solo. Poiché le nostre immagini sono molecolari, puoi identificare come queste cellule comunicano tra loro. Inoltre, poiché l’imaging MERFISH ha una sensibilità molto elevata, siamo in grado di identificare geni con bassa espressione che sono fondamentali per la funzione cellulare“.
Con queste informazioni, il team si proponeva di collegare specifiche cellule con comportamenti specifici e la soluzione è arrivata sotto forma di un gene chiamato c-Fos.
‘Conosciuto come quello che viene chiamato un gene “immediato precoce” o IEG.
Questi sono geni che vengono attivati in maniera repentina e transitoria in risposta ad una grande varietà di stimoli cellulari. Essi rappresentano un meccanismo di risposta precoce che viene attivato a livello trascrizionale, prima ancora che le altre proteine vengano sintetizzate. È per questa caratteristica che gli IEG si distinguono dai Geni dalla risposta tardiva che saranno attivati in un secondo momento e, solitamente, in maniera più consistente. I Geni immediati precoci sono quindi stati chiamati anche i geni dell'”accesso alla risposta genomica”. Tale termine è generico e può indicare dalle prime proteine virali prodotte in seguito all’infezione alle proteine cellulari prodotte in seguito a stimolazioni.
Finora sono stati individuati più di 40 IEG. I più conosciuti e meglio caratterizzati includono c-fos, c-myc e c-jun, geni che si è scoperto essere omologhi ad alcuni oncogeni retrovirali.
La trascrizione c-Fos risulta aumentata durante l’attività neurale’, ha detto Dulac, ‘quindi se i ricercatori sono in grado di rintracciare quali cellule mostrano aumenti nel gene, possono identificare le cellule che vengono attivate durante particolari comportamenti”, ha detto Dulac.” Ma grazie a MERFISH, sappiamo quali geni sono espressi in quelle cellule. Possiamo definire quali cellule sono coinvolte in un particolare comportamento”, ha continuato il ricercatore.
Oltre alla genitorialità, Dulac, Zhuang e colleghi hanno identificato le cellule responsabili di altri comportamenti, tra cui aggressività e accoppiamento e mentre trovavano sorprendenti aspetti comuni, trovavano anche interessanti differenze.
Andando avanti, Dulac e Zhuang sperano di esplorare ulteriormente la struttura dell’ipotalamo, compresi i modi per capire meglio come le cellule sono collegate l’una con l’altra.
Fonte, Science
