Immagine: fotografia del chip CARMEN a micropozzetti. Credito: Michael James Butts
I ricercatori hanno sviluppato una nuova tecnologia che aumenta in modo flessibile la diagnostica molecolare basata su CRISPR, utilizzando chip microfluidici che possono eseguire migliaia di test contemporaneamente. La capacità di un singolo chip varia dal rilevare un singolo tipo di virus in più di 1.000 campioni alla volta, alla ricerca in un piccolo numero di campioni di oltre 160 virus diversi, incluso il virus SARS-CoV-2.
Chiamata reazioni combinate per la valutazione multiplata degli acidi nucleici (CARMEN), questa tecnologia, validata su campioni di pazienti, fornisce risultati nello stesso giorno e potrebbe un giorno essere sfruttata per ampi sforzi di salute pubblica.
Lo studio appare in Nature, guidato dai co-primi autori Cheri Ackerman e Cameron Myhrvold, entrambi compagni post dottorato presso il Broad Institute of MIT e Harvard. Paul Blainey, membro principale del Broad Institute e Professore associato presso il Dipartimento di ingegneria biologica presso il MIT e Pardis Sabeti, membro dell’istituto presso Broad, Professore presso l’Università di Harvard e Howard Hughes Medical Institute Investigator, sono co-senior autori.
Miniaturizzazione della diagnostica CRISPR
Per costruire una piattaforma di test con questa capacità, il team si è rivolto alla microfluidica, adattando e migliorando la tecnologia sviluppata nel 2018 dal laboratorio di Blainey. I ricercatori hanno creato chip di gomma, leggermente più grandi di uno smartphone, con decine di migliaia di “micropozzetti”, piccoli scomparti progettati per contenere un paio di goccioline di dimensioni di nanolitro. Una goccia contiene materiale genetico virale da un campione e l’altra contiene reagenti per il rilevamento di virus.
“I chip per micropozzetti sono fatti come un francobollo: la gomma viene versata su uno stampo“, ha spiegato Ackerman. “Siamo facilmente in grado di replicare e condividere questa tecnologia con i collaboratori”.
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L’approccio di rilevamento utilizzato sui chip è adattato dallo SHERLOCK diagnostico basato su CRISPR, descritto per la prima volta nel 2017 e sviluppato da un team di scienziati del Broad Institute, il McGovern Institute for Brain Research del MIT, l’Institute for Medical Engineering & Science del MIT e il Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering presso la Harvard University. Per utilizzare la piattaforma CARMEN, i ricercatori prima estraggono l’RNA virale dai campioni e fanno copie di questo materiale genetico, simile al processo di preparazione per la diagnostica RT-qPCR attualmente utilizzato per i sospetti casi di COVID-19. I ricercatori quindi aggiungono un colorante fluorescente unico per ogni campione preparato e dividono la miscela in minuscole goccioline. Le miscele di rilevazione, d’altra parte, contengono la proteina CR13PR Cas13, un RNA guida che cerca una specifica sequenza virale e molecole per riportare i risultati. Queste miscele sono anche colorate e separate in goccioline. Migliaia di goccioline dai campioni e dalle miscele di rilevazione vengono quindi raggruppate e caricate su un chip in una singola fase di pipettaggio. Ogni micropozzetto nel chip cattura due goccioline. Quando una gocciolina di rilevazione trova il suo obiettivo – una specifica sequenza genetica virale – in una gocciolina di campione nello stesso micropozzetto, un segnale viene prodotto e rilevato da un microscopio a fluorescenza. L’intero protocollo, dall’estrazione dell’RNA ai risultati, richiede meno di otto ore.
“L’unione di queste due tecnologie in un’unica piattaforma ci offre nuove entusiasmanti capacità per indagare su questioni cliniche ed epidemiologiche”, ha affermato il co-autore Gowtham Thakku, uno studente laureato del MIT nel programma di malattie infettive e microbiomi di Broad. CARMEN consente oltre 4.500 test su un singolo chip microfluidico che può essere applicato ai campioni dei pazienti in vari modi utilizzando i codici fluorescenti disponibili. Ad esempio, un singolo chip potrebbe testare simultaneamente 1.048 campioni per un singolo virus o cinque campioni per 169 virus. La capacità può essere facilmente aumentata ulteriormente aggiungendo più chip: “Normalmente eseguiamo quattro o cinque chip in un solo giorno”, ha osservato Ackerman.
Funzionalità multiplexing
Per mostrare le capacità multi-diagnostiche della piattaforma, il team ha sviluppato una strategia per testare rapidamente dozzine di campioni per i 169 virus associati all’uomo che hanno più di 10 sequenze di genoma pubblicate. I ricercatori hanno testato questo pannello di rilevamento su 58 campioni di pazienti, utilizzando più chip. Hanno inoltre applicato CARMEN sui campioni dei pazienti per differenziare i sottotipi dei ceppi di influenza A e per rilevare le mutazioni di resistenza ai farmaci nell’HIV. Il team ha anche incorporato miscele di rilevazione per SARS-CoV-2 — il virus che causa COVID-19 — e altri agenti patogeni respiratori per dimostrare, usando sequenze virali sintetiche, come il dosaggio può essere rapidamente adattato per rilevare virus emergenti.
Insieme ai dati positivi dei test tratti dai campioni dei pazienti descritti oggi in Nature, questo approccio potrebbe essere facilmente traducibile in clinica, secondo il team. “Questo approccio miniaturizzato di diagnostica è efficiente in termini di risorse e facile da implementare”, ha affermato Blainey. “I nuovi strumenti richiedono creatività e innovazione e, con questi progressi in chimica e microfluidica, siamo entusiasti del potenziale di CARMEN poiché la comunità lavora per contrastare sia COVID-19 che le future minacce di malattie infettive”.
