(Fibrosi cistica-Immagine:questa ricerca suggerisce che un percorso per trattare i casi attualmente non trattabili di fibrosi cistica è chiaramente realizzabile. Credito: Fondazione per la fibrosi cistica).
Un farmaco sperimentale riportato su Nature Communications suggerisce un “percorso chiaramente realizzabile” per trattare casi attualmente non trattabili di fibrosi cistica causata da mutazioni senza senso. Ciò include circa l’11% dei pazienti con fibrosi cistica, così come i pazienti con altre malattie genetiche, tra cui la distrofia muscolare di Duchenne, la -talassemia e numerosi tipi di cancro, anch’essi causati da mutazioni senza senso.
“Il farmaco è una piccola molecola con un nuovo meccanismo d’azione”, affermano David Bedwell, Ph.D. e Steven Rowe, MD, MSPH, co-autori senior. Bedwell è Professore e Presidente dell’Università dell’Alabama presso il Dipartimento di Biochimica e Genetica Molecolare di Birmingham e Rowe è Professore presso il Dipartimento di Medicina dell’UAB.
Per capire come una mutazione senza senso causi la malattia e come il farmaco sperimentale agisca per sopprimere la mutazione, è necessario uno sguardo ravvicinato al meccanismo biologico che produce le proteine all’interno di una cellula.
Una proteina è una catena di centinaia di amminoacidi che poi si ripiega nella sua forma corretta e si sposta al suo posto giusto per svolgere la sua funzione. La catena è costituita, anello per anello, da ribosomi che leggono una sequenza per la proteina trasportata sull’RNA messaggero. Quella sequenza indica quale dei 20 diversi amminoacidi aggiungere a ciascun collegamento, uno per uno.
Nella fibrosi cistica, le mutazioni colpiscono la proteina CFTR che funziona sulla superficie delle cellule polmonari per regolare il flusso d’acqua verso il muco. Un CFTR malfunzionante o assente crea muco molto appiccicoso che permette infezioni ai polmoni. Una mutazione genetica che modifica una delle basi nucleotidiche dell’RNA messaggero può causare l’inserimento di un amminoacido errato nella catena proteica, alterandone la funzione. I codoni di terminazione prematura senza senso studiati da Bedwell e Rowe causano un problema diverso: la mutazione costringe il ribosoma a interrompere la sintesi proteica a metà corso, producendo una proteina incompleta. Provoca anche il decadimento dell’mRNA.
Vedi anche:Fibrosi cistica: la nanotecnologia migliora il trattamento
Pertanto, Bedwell, Rowe e colleghi volevano trovare composti a piccole molecole che avrebbero fatto saltare il ribosoma attraverso la mutazione di arresto prematura senza senso, consentendo al ribosoma di continuare la sintesi completa della proteina. I ricercatori speravano di trovare agenti readthrough che avessero un nuovo meccanismo e potessero funzionare meglio di quelli attuali, come gli antibiotici aminoglicosidici che hanno scarsa efficacia.
I ricercatori hanno utilizzato cellule di ratto che trasportavano un gene modificato da un gambero di acque profonde per testare centinaia di migliaia di composti. Il gene codifica per la luciferasi NanoLuc, ma con una modifica per posizionare un codone di terminazione prematura a metà del gene. Una piccola molecola che induce il ribosoma a leggere attraverso l’arresto prematuro produrrebbe luciferasi intatta, facendo risplendere le cellule di una brillante luminescenza.
Questo gene reporter ha permesso a un team della Southern Research di testare 771.345 composti, utilizzando uno screening ad alto rendimento. Dei 180 composti che mostravano attività di readthrough, la piccola molecola SRI-37240 era la più attiva.
I ricercatori hanno scoperto che SRI-37240 ha ripristinato la funzione dei geni CFTR umani con mutazioni del codone di terminazione prematura, come testato in colture di cellule di ratto. Ha aumentato significativamente la quantità di proteina CFTR e ha leggermente aumentato la quantità di RNA messaggero CFTR. Un aminoglicoside chiamato G418 è noto per aiutare la lettura delle mutazioni premature del codone e i ricercatori hanno scoperto che SRI-37240 e G418 hanno agito in sinergia per ripristinare la funzione CFTR.
Hanno scoperto che SRI-37240 induce una pausa prolungata ai codoni di stop dell’RNA messaggero e inibisce la terminazione della sintesi proteica ai codoni di terminazione prematura senza stimolare il readthrough ai normali codoni di terminazione trovati alla fine della sequenza di codifica delle proteine sull’RNA messaggero.
I chimici hanno sintetizzato 40 derivati di SRI-37240 e uno, SRI-41315, era più potente e mostrava migliori caratteristiche fisico-chimiche. Nelle linee cellulari umane con il gene reporter NanoLuc, SRI-41315 ha mostrato un’efficienza di lettura molto maggiore rispetto a SRI-37240 e SRI-41315 ha agito in sinergia con G418.
I complessi ribosomiali includono proteine ribosomiali e altre proteine che funzionano come fattori di terminazione, fattori di traduzione e fattori di decadimento dell’mRNA mediati da non senso. I ricercatori hanno esaminato l’abbondanza di sette di quelle proteine e hanno scoperto che SRI-41315 ha ridotto drasticamente un singolo fattore di terminazione chiamato eRF1, attraverso un percorso dipendente dalla degradazione del proteasoma. Questo nuovo meccanismo non è stato visto in precedenza in un agente farmacologico.
Per prevedere l’efficacia clinica per la fibrosi cistica, i ricercatori hanno testato cellule epiteliali bronchiali umane primarie che avevano codoni di terminazione prematura CFTR endogeni. Né SRI-37240 né SRI-41315 da soli hanno aumentato la funzione CFTR, ma SRI-41315 insieme a G418 hanno mostrato un aumento significativo della funzione.
“Questo è un progresso”, dicono Bedwell e Rowe, “ma gli ostacoli rimangono. Sfortunatamente, i due composti hanno avuto un effetto deleterio sulla conduttanza ionica mediata dal canale epiteliale del sodio, che limita lo sviluppo nella loro forma attuale come trattamento per la fibrosi cistica. Anche il già noto effetto readthrough degli aminoglicosidi è limitato perché questi antibiotici non ripristinano i livelli terapeutici di CFTR, inoltre devono essere somministrati per via endovenosa e possono essere tossici”.
Bedwell e Rowe affermano che è sempre più probabile che siano necessari più agenti distinti con diversi meccanismi d’azione per impartire una risposta clinicamente efficace. Hanno concluso: “Mentre è necessaria un’ulteriore fricerca chimica per identificare i composti readthrough che hanno un impatto massimo sulla funzione CFTR senza effetti indesiderati fuori bersaglio, i risultati qui presentati suggeriscono che questo percorso è chiaramente realizzabile”.
I co-primi autori dello studio, “Una piccola molecola che induce il readthrough traslazionale di mutazioni non senso CFTR mediante deplezione di eRF1″, sono Jyoti Sharma, Dipartimento di Medicina UAB e Ming Du, Dipartimento di Biochimica e Genetica Molecolare UAB.
