La citometria a flusso può essere uno strumento vitale nella terapia con cellule CAR T, utilizzata nella raccolta dei linfociti, nel monitoraggio in vivo e nella valutazione funzionale delle cellule infuse. Credito: Slingshot Biosciences, Inc.
Questa tecnologia ha un vasto potenziale per aiutare i pazienti, ma rimane sottoutilizzata e sottovalutata. Gli strumenti ci sono. Ciò che manca sono controlli armonizzati, linee guida normative e opzioni di database per la condivisione di test convalidati.
Potrebbe sorprendere molti sapere che alcuni dei trattamenti più avanzati di oggi, come le terapie cellulari per il cancro, il diabete e l’autoimmunità, dipendono dalla citometria a flusso, una tecnologia vecchia di 50 anni.
La terapia con il recettore dell’antigene chimerico (CAR), ad esempio, prevede la rimozione delle cellule di un paziente, la riprogrammazione e la reimmissione nel paziente, per cercare e distruggere il cancro. E il ruolo della citometria a flusso? “È il modo in cui si identificano le cellule che verranno inserite nel prodotto“, afferma Therese Choquette, responsabile delle scienze analitiche presso la Tigen Pharma svizzera.
Sebbene la citometria a flusso stia affrontando sfide biomediche moderne e complesse – dallo sviluppo di farmaci alla diagnosi e al monitoraggio dei pazienti – l’approvazione normativa non ha tenuto il passo con i progressi tecnici. La maggior parte dei test di citometria a flusso sono test sviluppati in laboratorio (LDT), progettati, prodotti e convalidati all’interno di un singolo laboratorio. Attualmente, esistono opzioni di database limitate per la condivisione di approfondimenti sui test di citometria a flusso e la mancanza di controlli standardizzati dalla FDA rende difficile lo sviluppo dei test. Ciò è in netto contrasto con campi come la chimica clinica, dove i metodi sono strettamente regolamentati e armonizzati utilizzando controlli. “Le linee guida oggi disponibili per la validazione dei metodi analitici non sono adatte alla terapia cellulare“, afferma Choquette. “Quindi, devi essere davvero innovativo”.
Di conseguenza, Choquette e i suoi colleghi non devono solo sviluppare nuovi test per ogni tipo di cellula, ma devono anche creare un modo per testare l’accuratezza del test. Con linee guida normative più specifiche e controlli armonizzati, questo processo potrebbe essere snellito, accelerando il processo di sviluppo e migliorando il time-to-market per le nuove terapie.
Non sono in gioco solo il tempo e il denaro dei ricercatori: senza approcci più snelli alla standardizzazione dei test di citometria a flusso, c’è il rischio che i pazienti perdano terapie potenzialmente salvavita.
Cos’è la citometria a flusso?
Il primo citometro a flusso commerciale è stato sviluppato come strumento di ricerca negli anni ’60 e molti medici lo considerano ancora come uno strumento di ricerca.
“La citometria a flusso fornisce risultati clinicamente importanti e utilizzabili”, afferma Oral Alpan, allergologo e immunologo e fondatore della biotecnologia Amerimmune. “Ma la comunità deve essere informata sull’uso della citometria a flusso nella medicina clinica“.
“In un citometro a flusso, le cellule sospese in una soluzione si muovono, una per una, attraverso la luce laser. I rilevatori circostanti raccolgono la luce riflessa, ricavando informazioni sulle cellule. In un campione preparato, ad esempio, con un anticorpo marcato in modo fluorescente, i marcatori della superficie cellulare possono essere analizzati per la diagnosi e la fenotipizzazione della malattia; la citometria a flusso può contare i cambiamenti indotti dal cancro nei globuli bianchi e nei recettori della superficie cellulare associati alla crescita del cancro, e molto di piu”, spiegano gli autori.
L’oncologia è il terreno più fertile per nuove applicazioni della citometria a flusso. Come Hemant Mishra, scienziato principale della Caribou Biosciences, ha scritto in una revisione della citometria a flusso nell’immunoterapia: “Oltre alla diagnosi, ci sono molte altre applicazioni della citometria a flusso nella gestione di vari tumori che includono il monitoraggio del trattamento, o anche la selezione di un immunoterapia personalizzata basata sulla precisione in sincronia con test genetici avanzati per aumentare le possibilità di prognosi favorevole e di remissione completa”.
Andy Rawstron, consulente scientifico clinico presso l’HMDS (Haematology Malignancy Diagnostic Service) di Leeds, Regno Unito, concorda: “Recentemente ci siamo concentrati sullo sviluppo di test ad alta sensibilità per rilevare livelli molto bassi di malattia residua in uno spettro più ampio di tumori del sangue”. Questi test possono rilevare alcuni tipi di linfoma a livelli 10-100 volte inferiori rispetto ai metodi esistenti.
Il numero di bersagli molecolari che possono essere tracciati nei moderni citometri aumenta man mano che la tecnologia matura. “Ora possiamo identificare quali persone con cancro del sangue in stadio iniziale sono maggiormente a rischio di infezione o che hanno una risposta al trattamento non ottimale”, afferma Rawstron.
Oltre l’oncologia
Ma la citometria a flusso non si limita alla cura del cancro e può essere utilizzata per personalizzare il trattamento per molte condizioni. “Un numero crescente di piccoli inibitori molecolari e di anticorpi terapeutici colpiscono efficacemente i disturbi autoimmuni”, afferma Rawstron. Alcuni trattamenti necessitano di una diagnostica complementare per confermare l’idoneità del farmaco per il paziente. Se ciò comporta, ad esempio, il monitoraggio di un gene per uno specifico marcatore della superficie cellulare, la citometria a flusso può rilevarlo.
Nel 2015, Rawstron e colleghi hanno utilizzato la citometria a flusso per valutare gli esiti del trattamento con Metotrexato nell’artrite reumatoide. Il Metotrexato non produce una risposta se non elimina un numero sufficiente di cellule B maligne. La citometria a flusso può contare queste cellule. “Se la tecnologia rileva che il Metotrexato non riduce adeguatamente il carico di cellule B di un paziente, una dose extra del farmaco “produce sia una migliore deplezione che risposte cliniche rispetto al placebo senza alcun peggioramento della sicurezza”, ha riferito il team di Rawstron.
I test esistenti possono essere applicati anche a più malattie. Alpan descrive il test di attivazione dei basofili (BAT), che utilizza la citometria a flusso per rilevare i cambiamenti superficiali in queste cellule immunitarie dopo l’esposizione a un allergene. “Segnalato per la prima volta 32 anni fa, il test BAT non è stato ancora approvato dalla FDA, perché non c’è stata alcuna spinta da parte dell’industria a commercializzarlo o convalidarlo clinicamente“, afferma Alpan. Lui e i suoi colleghi hanno utilizzato il test per prevedere una serie di allergie agli alimenti, comprese le arachidi.
Si prevede che le cellule CAR verranno utilizzate anche al di fuori dell’oncologia. L’approccio CAR standard utilizza le cellule T, che sono preparate a combattere le infezioni. Con il giusto editing genetico, possono essere progettate per affrontare qualsiasi cosa, dall’insufficienza cardiaca alle infezioni fungine.
Per queste applicazioni in espansione, la citometria a flusso fornisce una finestra sulle popolazioni cellulari. Affinché la tecnologia possa essere adottata su larga scala nello spazio clinico, tuttavia, i test devono essere convalidati, utilizzando controlli per separare il target previsto dai segnali di fondo e per la riproducibilità su larga scala. [vedi ‘Il potenziale potere di approvazione per i test di citometria a flusso’].
La sfida è che ci sono pochi controlli standard. “Un problema importante per la citometria a flusso è la mancanza di standard cellulari con espressione nota delle proteine di interesse”, afferma Rawstron.
Superando gli ostacoli
Lentamente, i sostenitori della citometria a flusso stanno affrontando questi problemi. Alpan e i suoi colleghi stanno lavorando per ottenere l’approvazione da parte della FDA del loro test BAT. Raccomandano di impegnarsi con le autorità di regolamentazione per discutere le caratteristiche tecniche di un test, come gli strumenti e i reagenti da utilizzare, durante la fase di pianificazione di uno studio. Si spera che ciò possa ridurre alcune delle sfide sollevate nelle fasi normative successive.
Choquette spera che i risultati possano essere resi più riproducibili tra i laboratori utilizzando controlli sintetici. “Slingshot Biosciences fornisce set standardizzati di imitazioni delle cellule T che hanno le stesse proprietà delle cellule su cui stai lavorando“, spiega. “Questo aiuta con la convalida“.
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Slingshot continua ad espandere la propria offerta di tipi di cellule di controllo, etichettate con un’ampia selezione di marcatori per molti usi. L’azienda produce globuli bianchi sintetici per sostituire la loro controparte biologica, notoriamente scarsa stabilità e consistenza, con un prodotto robusto per applicazioni precliniche e commerciali.
I buoni controlli sono una parte importante della conversazione sulla citometria a flusso, ma non l’unica. Sarà importante anche una migliore formazione dei medici sull’uso della tecnologia: dallo sviluppo, alla produzione, alla diagnostica. Come dice Choquette, “Ogni nuovo prodotto riguarda sempre i pazienti e la speranza che dà loro”.
Fonte: Nature
