CRISPR: comprendere la terapia

CRISPR: un primer

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CRISPR, o Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, è una tecnologia avanzata sviluppata nel 2012 che può essere utilizzata per modificare i geni. Può essere utilizzata per trovare sequenze specifiche di DNA all’interno delle cellule per modificare il DNA. Questa tecnologia innovativa è stata anche adattata per applicazioni come l’attivazione o disattivazione di un gene senza modificarne la sequenza.

Sebbene esistessero tecniche di editing genetico precedenti all’istituzione di CRISPR, queste richiedevano molto tempo, impiegavano anni per prendere piede e costavano centinaia di migliaia di dollari. Tuttavia, lo sviluppo di CRISPR ha rivoluzionato questo processo, fornendo una tecnica più economica e semplice per l’editing genetico, che è già ampiamente utilizzata nella ricerca scientifica.

Il componente chiave del sistema CRISPR include la proteina Cas9, che si trova nei batteri dove difende dai virus. La proteina Cas9 può essere facilmente programmata per identificare e legarsi a qualsiasi sequenza di DNA mirata fornendo un pezzo di RNA come guida per la sua ricerca. La proteina Cas9 standard taglia quindi il DNA nel sito bersaglio e, quando il taglio viene riparato, vengono introdotte mutazioni che in genere disattivano il gene. 

Questa applicazione di CRISPR è la più utilizzata ed è nota come editing del genoma o dei geni; tuttavia, i risultati non sono così precisi come sembrano. Mentre CRISPR può essere utilizzato per apportare modifiche più precise, come la sostituzione di geni disfunzionali, che è il vero editing del genoma, questo processo è più difficile.

CRISPR e malattie umane

Il potenziale dell’applicazione CRISPR per il trattamento di disturbi genetici potrebbe essere monumentale, con questa applicazione che consente il trattamento di malattie come l’anemia falciforme, la fibrosi cistica e persino il cancro. Questa applicazione terapeutica sarebbe rivoluzionaria per l’assistenza sanitaria della popolazione globale, con disturbi genetici e anomalie congenite presenti nel 2-5% delle nascite in tutto il mondo e responsabili fino al 50% di tutta la mortalità infantile precoce.

L’anemia falciforme è una malattia autosomica recessiva ereditaria con una mutazione che sostituisce un amminoacido sul cromosoma 11, con l’acido glutammico sostituito dalla valina. Questa singola sostituzione di amminoacido provoca la formazione di emoglobina S, che è la forma di emoglobina che causa la malattia. Successivamente, porta a globuli rossi deformi che assumono una forma a mezzaluna che sembra una falce al microscopio. 

I globuli rossi rigidi e distorti causano tutti i sintomi della malattia delle cellule falciformi ostruendo i vasi sanguigni, inibendo il flusso sanguigno e causando forti dolori nelle aree che non ricevono una circolazione adeguata. Questa ostruzione provoca anche ostruzioni nel cuore, nei polmoni, nel fegato e negli occhi. 

Sebbene non esista un trattamento definito per chi è affetto da anemia falciforme, ci sono due farmaci approvati dalla FDA che riducono la gravità del disturbo. Tuttavia, con l’emergere di CRISPR, due importanti applicazioni terapeutiche possono funzionare per curare l’anemia falciforme, tra cui la riparazione dei geni per l’emoglobina S o la sostituzione dell’emoglobina S con l’emoglobina F. 

CRISPR-Cas9 può anche essere utilizzato per riparare il gene CFTR disfunzionale che causa la fibrosi cistica. Con la riparazione genica mediata da CRISPR, la sua funzionalità può essere ripristinata, prevenendo l’insufficienza respiratoria causata dalla malattia. 

Nel 2018 è stato avviato negli Stati Uniti il ​​primo studio clinico di fase I CRISPR, con l’obiettivo di utilizzare CRISPR/Cas9 per modificare le cellule T autologhe per l’immunoterapia contro molti tumori diversi con tumori recidivanti, ma senza un’ulteriore richiesta di opzioni di trattamento curativo ^.

È stato esplorato anche l’uso di CRISPR in malattie infettive come l’HIV. Il principio alla base di questo è quello di ridurre l’infezione da HIV-1 e rimuovere i provirus prendendo di mira i cofattori cellulari, che è stato utilizzato per la prima volta nel 2013 per il trattamento dell’HIV-1/AIDS.

Il potenziale della tecnologia CRISPR di colpire altre infezioni causate da virus è anch’esso significativo, poiché è solitamente molto difficile eliminare i virus dopo che hanno trovato un posto in cui replicarsi all’interno di una cellula ospite. Di conseguenza, gli approcci basati su CRISPR possono essere utilizzati per colpire sequenze virali per impedire ai virus di essere in grado di passare attraverso la trascrizione o la replicazione. Il potenziale della terapia genica CRISPR può essere utilizzato a livello globale e potrebbe persino rivoluzionare l’assistenza sanitaria nei paesi in via di sviluppo.

Sfide e considerazioni tecniche

Sebbene la tecnologia CRISPR possa consentire progressi nella medicina e nella ricerca biomedica, ci sono anche alcune limitazioni, tra cui i suoi effetti off-target. L‘elevata frequenza di effetti off-target è una delle principali preoccupazioni per l’implementazione di CRISPR per la terapia genica. ³

Tuttavia, ci sono tentativi attuali che mirano a superare questa limitazione, tra cui varianti di Cas9 ingegnerizzate che dimostrano effetti off-target ridotti e l’ottimizzazione dei design guida. Ciò include un approccio che utilizza la nickasi Cas9, che è una variante che induce rotture a singolo filamento in combinazione con una singola coppia di RNA guida che prende di mira entrambi i filamenti di DNA nel sito bersaglio per produrre una rottura a doppio filamento. 

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Anche la modalità di somministrazione della terapia genica è una sfida, poiché ha un impatto significativo sulla sicurezza e sulla sua efficacia terapeutica. La terapia genica tradizionale utilizza i virus come veicolo di somministrazione; tuttavia, ciò comporta rischi quali immunotossicità e oncogenesi inserzionale. 

I vettori del virus adeno-associato (AAV) vengono utilizzati come vettori di somministrazione per la terapia genica CRISPR, con il sistema CRISPR confezionato come DNA plasmidico che codifica i suoi componenti come Cas9 e RNA guida o consegnato come mRNA di Cas9 e RNA guida.

Gli acidi nucleici di CRISPR possono essere confezionati in vettori AAV per la somministrazione o somministrati nelle cellule bersaglio tramite elettroporazione o microiniezione, con quest’ultimo approccio che elimina i rischi associati al virus.Tuttavia, le condizioni di questi ultimi metodi possono anche essere impegnative poiché ogni esigenza terapeutica di CRISPR richiede una quantità significativa di enzimi di modifica del genoma nelle cellule, il che può significare la somministrazione di più macromolecole contemporaneamente. 

Fonte: Newscientist