Immagine: sezioni istologiche di fegato da topi di controllo trattati con soluzione salina (a sinistra) e il sistema di repressione epigenetico CRISPR / Cas9 in cui i livelli di colesterolo sono stati abbassati (a destra) mostrano generalmente tessuto normale e sano. Credit: Charles Gersbach, Duke University.
Gli ingegneri biomedici della Duke University hanno utilizzato la tecnica di ingegneria genetica CRISPR / Cas9 per disattivare un gene che regola i livelli di colesterolo nei topi adulti, ottenendo la riduzione dei livelli di colesterolo nel sangue e la repressione genetica per sei mesi dopo un singolo trattamento.
E’ la prima volta che i ricercatori hanno consegnato repressori CRISPR / Cas9 per il silenziamento genico terapeutico mirato in modelli animali adulti.
Lo studio è apparso online su Nature Communications il 26 aprile.
Il sistema CRISPR / Cas9 si basa su un meccanismo di difesa antivirale nei batteri in cui l’enzima Cas9 riconosce le sequenze del DNA virale di precedenti infezioni e riduce il DNA invasivo durante la reinfezione. I ricercatori hanno progettato il sistema CRISPR / Cas9 non solo per localizzare e tagliare sequenze specifiche di DNA, ma anche per attivare o disattivare l’espressione di geni mirati senza apportare modifiche permanenti alla sequenza di codifica del DNA.
Anche se questa tecnica di repressione CRISPR / Cas9 è emersa come uno strumento robusto per interrompere la regolazione genica in modelli di colture cellulari, non era ancora stata adattata per la somministrazione ad animali adulti per applicazioni come la terapia genica.
Nel loro studio più recente, Charles Gersbach, Professore associato della Rooney Family Associate of Biomedical Engineering presso la Duke e membri del suo laboratorio, hanno sviluppato un approccio per confezionare e consegnare efficientemente il sistema di repressione CRISPR / Cas9 ai topi. Hanno testato il loro sistema di rilascio mettendo a tacere Pcsk9, un gene che regola i livelli di colesterolo.
“In precedenza abbiamo utilizzato questi stessi tipi di strumenti per attivare e disattivare i geni nelle cellule in coltura e volevamo vedere se potevamo anche consegnarli a modelli animali con un approccio che è rilevante per la terapia genetica”, ha detto Gersbach. “Volevamo cambiare i geni in un modo che avrebbe avuto un esito terapeutico e Pcsk9 è un utile proof-of-concept dato il suo ruolo nel regolare i livelli di colesterolo, che a loro volta influenzano problemi di salute come le malattie cardiache”.
Per testare il repressore Pcsk9 mirato in un animale adulto, il team ha scelto di utilizzare vettori virali (AAV) adeno-associati – piccoli virus che sono stati progettati per colpire una varietà di tipi di tessuto in studi clinici di terapia genica umana. A causa del limitato limite di carico del vettore, il team non ha potuto utilizzare l’enzima Cas9 comune di Streptococcus pyogenes, ma ha scelto di usare un Cas9 più piccolo da Staphylococcus aureus. I ricercatori hanno anche disattivato la funzione di taglio del DNA di Cas9, creando una versione “morta” dell’enzima, dCas9, che si lega ma non taglia la sequenza mirata del DNA.
Il dCas9 può essere combinato con una proteina KRAB che silenzia l’espressione genica, creando un repressore CRISPR / Cas9 che blocca la trascrizione, riduce l’accessibilità alla cromatina e l’espressione del gene senza alterare la sequenza sottostante del DNA. Utilizzando un vettore di adenovirus per fornire repressori basati su CRISPR / Cas9 al fegato di topo, i ricercatori hanno ridotto i livelli di Pcsk9 e di colesterolo nei topi trattati.
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Mentre l’esperimento ha avuto successo, i ricercatori hanno anche osservato il rilascio di enzimi epatici nel sangue solo nei trattamenti che includevano Cas9, ma questi livelli di enzimi epatici sono rimasti al di sotto di una soglia critica e normalizzati nel tempo. L’aumento di questi livelli indica che la terapia potenzialmente ha causato risposte immunitarie nel fegato, dove il virus e l’enzima Cas9 si accumulano. Ciò tuttavia, solleva domande sull’efficacia delle iniezioni multiple.
“Una delle cose interessanti che abbiamo trovato sembrava una risposta immunitaria contro la proteina Cas9“, ha detto Pratiksha Thakore, dottorando che ha guidato il lavoro nel laboratorio di Gersbach. “Dopo l’iniezione, abbiamo visto che i livelli del nostro gene bersaglio, Pcsk9, erano ridotti, ma abbiamo anche osservato un aumento nell’espressione di molti geni delle cellule immunitarie, che indica che le cellule immunitarie si stavano infiltrando nel fegato dopo che abbiamo consegnato Cas9 ai topi. Una migliore comprensione di questa risposta immunitaria e di come modularla sarà importante per l’utilizzo delle tecnologie Cas9 per le terapie “.
Mentre i ricercatori sviluppano nuovi modi per utilizzare CRISPR / Cas9 per la terapia e la ricerca, stanno emergendo ulteriori informazioni su come il sistema immunitario degli organismi viventi risponde alla consegna del sistema CRISPR / Cas9. Poiché l’enzima Cas9 è derivato da batteri, il sistema immunitario può riconoscerlo come una proteina estranea da un organismo invasore e generare una risposta. C’è anche preoccupazione che i potenziali pazienti per una terapia basata su CRISPR / Cas9 possano già essere predisposti ad ospitare risposte immunitarie contro questi sistemi, perché gli enzimi Cas9 più comunemente usati nella ricerca provengono da comuni batteri a cui gli esseri umani sono abitualmente esposti.
“E’ chiaro che la risposta immunitaria è un problema importante”, ha detto Gersbach. “Sebbene abbiamo visto una risposta immunitaria nei topi quando abbiamo somministrato Cas9, i livelli degli enzimi epatici nel siero sembravano attenuarsi nel tempo senza alcun intervento e l’effetto della repressione di Pcsk9 è stato sostenuto a prescindere.”
Mentre proseguono la ricerca, Gersbach ed i suoi collaboratori sperano di raccogliere più informazioni per comprendere meglio la risposta immunitaria contro Cas9 e la stabilità della modulazione epigenetica.
“Ci sono ancora molte cose da esplorare in questo approccio”, ha detto Thakore. “Gli strumenti CRISPR / Cas9 hanno funzionato così bene nei modelli di colture cellulari che è emozionante applicarli in vivo, specialmente quando stiamo esaminando importanti bersagli terapeutici e utilizzando veicoli di consegna che sarebbero rilevanti per il trattamento di malattie umane”.
Fonte: Duke University
