I ricercatori del Broad Institute del MIT e di Harvard e dell’Università di Princeton hanno sviluppato una tecnologia basata su CRISPR in grado di differenziare rapidamente tra omicron, delta e altre varianti di COVID-19, nonché altri virus respiratori, compresa l’influenza.
Il team ha utilizzato il metodo, noto come mCARMEN, durante l’inizio del picco di omicron nel dicembre 2021 per dare uno sguardo provvisorio alla crescente prevalenza della variante in Massachusetts. Sulla base di questi risultati, il Dipartimento della salute pubblica del Massachusetts (MDPH) ha condiviso queste informazioni con gli Ospedali dello stato per aiutare a guidare le opzioni di trattamento per i pazienti COVID-19.
Per progettare mCARMEN, i ricercatori hanno adattato CARMEN, la tecnologia diagnostica basata su CRISPR sviluppata al Broad nel 2020, per essere più veloce, più sensibile e più facilmente implementabile nei laboratori clinici e di sorveglianza, con l’obiettivo di utilizzare la piattaforma ottimizzata più ampiamente durante futuri focolai di SARS-CoV-2 o altri agenti patogeni.
Il metodo mCARMEN, acronimo di “microfluidic Combinatorial Arrayed Reactions for Multiplexed Evaluation of Nucleic acid”, è stato descritto in Nature Medicine.
“La pandemia di COVID-19 ci mostra che abbiamo bisogno di più test, più spesso, in particolare all’inizio di una pandemia”, ha affermato il co-autore senior Cameron Myhrvold, che ha contribuito a sviluppare CARMEN come ricercatore post-dottorato al Broad e ora è un assistente Professore di biologia molecolare all’Università di Princeton. “COVID-19 ci mostra che i virus impegnativi continueranno a emergere, quindi dobbiamo continuare a cercarli e trovare modi migliori per farlo”.
“È stato meraviglioso lavorare a questo grande progetto di collaborazione”, ha affermato la prima autrice dello studio Nicole Welch, una studentessa laureata nel programma di virologia dell’Università di Harvard e nel laboratorio di Pardis Sabeti al Broad. “Siamo entusiasti del fatto che CARMEN stia già facendo la differenza in questa pandemia e speriamo di vederne l’uso continuato per migliorare la salute pubblica “.
CARMEN V1
I ricercatori nei laboratori di Sabeti e del membro principale di Broad Paul Blainey hanno sviluppato per la prima volta la piattaforma CARMEN utilizzando chip microfluidici personalizzati e molecole di RNA guida basate su CRISPR in grado di rilevare sequenze specifiche nel materiale genetico di un patogeno. In uno studio del 2020, i ricercatori hanno dimostrato che CARMEN potrebbe identificare un singolo tipo di virus in più di 1.000 campioni alla volta o cercare più di 160 virus diversi, incluso il virus COVID-19, in un piccolo numero di campioni.
Tuttavia, la piattaforma CARMEN originale richiede apparecchiature personalizzate, comporta un flusso di lavoro manuale intensivo da 8 a 10 ore e offre una produttività inferiore rispetto a quella necessaria durante una pandemia. Per rispondere meglio alle minacce per la salute pubblica come l’emergere di nuove varianti SARS-CoV-2, i ricercatori hanno perfezionato la tecnologia nel 2021 per renderla più utile clinicamente e consentirle di rilevare rapidamente più virus e varianti.
Il team ha adattato CARMEN per lavorare sulla piattaforma di microfluidica e strumentazione Fluidigm disponibile in commercio, semplificando l’esecuzione e dimezzando il tempo di esecuzione. I ricercatori hanno anche ottimizzato il flusso di lavoro per una maggiore sensibilità, in modo che possa rilevare agenti patogeni in campioni con meno materiale genetico. Inoltre, utilizzando gli enzimi basati su CRISPR Cas12 e Cas13 in combinazione, mCARMEN non solo può individuare la presenza di un virus, ma anche misurare la quantità di virus in un campione, informazioni che possono indicare la capacità di un paziente di infettare gli altri o se un il trattamento sta funzionando.
Visualizzazione delle varianti
Nel loro ultimo studio, gli scienziati hanno dimostrato che mCARMEN potrebbe distinguere tra 21 diversi virus respiratori umani nei campioni dei pazienti, tra cui SARS-CoV-2, altri coronavirus e ceppi influenzali, con prestazioni simili alla tecnologia CARMEN originale. Lavorando con i partner del Massachusetts General Hospital, i ricercatori hanno ulteriormente dimostrato la capacità di mCARMEN di rilevare e distinguere tra numerosi virus respiratori umani nei campioni dei pazienti.
Per consentire a mCARMEN sia di diagnosticare i pazienti che di monitorare le varianti emergenti di COVID-19, i ricercatori hanno anche sviluppato un modo per la piattaforma di tenere traccia dei cambiamenti nel virus SARS-CoV-2. Hanno ideato un “pannello di identificazione delle varianti” di RNA guida basati su CRISPR che riconoscono più di due dozzine di mutazioni nella proteina spike del virus. Ogni variante ha un modello unico di queste mutazioni che può fungere da “impronta digitale” per la variante in un campione. Con questo pannello, il team ha dimostrato che mCARMEN può cercare queste impronte digitali e distinguere tra sei lignaggi varianti SARS-CoV-2, inclusi delta e omicron, con la stessa precisione che si può fare con il sequenziamento virale.
I ricercatori affermano che mCARMEN può anche aiutare a segnalare nuove varianti. Se un’impronta digitale mutazionale virale sconosciuta si presenta in un campione, può segnalare che potrebbe emergere una nuova variante, che può essere confermata con un sequenziamento virale più approfondito.
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In collaborazione con i Centri statunitensi per il controllo e la prevenzione delle malattie e l’MDPH, il Broad Institute conduce un sequenziamento virale su larga scala per supportare la sorveglianza genomica COVID-19 da marzo 2021. Con l’emergere della variante omicron alla fine del 2021, l’MDPH ha chiesto a Broad di utilizzare mCARMEN per testare campioni di COVID-19 provenienti da tutto il Massachusetts e fornire un’analisi preliminare più rapida della prevalenza di omicron per la consapevolezza situazionale della salute pubblica. Alla fine di dicembre 2021, la piattaforma di genomica ha consegnato un sottoinsieme di campioni positivi al COVID dal flusso di lavoro di sorveglianza virale al team che ha sviluppato la piattaforma mCARMEN.
Il team di mCARMEN ha utilizzato la propria piattaforma per elaborare quasi 1.000 campioni in un giorno e generare rapidamente un quadro delle varianti che circolano all’interno dello stato. I ricercatori hanno stimato che l’omcron fosse la variante dominante di COVID-19 in Massachusetts da metà dicembre. Oltre a dimostrare la capacità della piattaforma di generare rapidamente informazioni da un numero relativamente piccolo di campioni, la scoperta ha avuto anche un impatto in tempo reale sulla risposta a COVID dello stato. MDPH è stato in grado di contattare gli Ospedali della zona e consigliare che quando si utilizzano anticorpi monoclonali per il trattamento dei pazienti COVID-19, ora dovrebbero scegliere quelli più adatti all’omicron che al delta o ad altre varianti.
“Con i rapidi tempi di risposta di mCARMEN, potremmo aiutare a supportare quella risposta immediata della salute pubblica”, ha affermato Welch. “L’epidemia di omicron mostra la necessità di una diagnostica che fornisca più informazioni rispetto ai test standard basati sulla PCR, senza il costo o il tempo richiesto dall sequenziamento virale”.
mCARMEN richiede l’approvazione normativa per essere utilizzato per diagnosticare i pazienti. Per ora, il team sta continuando a utilizzare la tecnologia in collaborazione con i colleghi della Genomics Platform, del CDC e dell’MDPH per monitorare l’omicron e altre varianti di COVID-19. Quando emergeranno nuove varianti, potranno facilmente aggiungere nuovi pannelli di mutazioni varianti al flusso di lavoro di mCARMEN, per scoprire cosa sta circolando e supportare le risposte di salute pubblica.
Il team sta anche lavorando con i dipartimenti di salute pubblica in tutto il paese e oltre per utilizzare mCARMEN per la sorveglianza dei virus in quelle regioni. Inoltre, sta supportando i ricercatori che stanno sviluppando nuove applicazioni della piattaforma oltre la pandemia di COVID-19, come il rilevamento e la discriminazione delle infezioni batteriche e il monitoraggio della resistenza agli antibiotici.
“La nostra speranza è quella di diffondere questa tecnologia in modo molto più ampio”, ha affermato il co-autore senior Pardis Sabeti, membro dell’istituto presso il Broad, professore all’Università di Harvard e ricercatore dell’Howard Hughes Medical Institute. “Con questo aggiornamento della piattaforma CARMEN, possiamo progettare pannelli per una varietà di usi, che ci aiuteranno a prepararci per la prossima minaccia di malattie infettive”.
Fonte:Nature
