Proteomica spaziale-Immagine: l’Human Protein Atlas ha mappato le posizioni delle proteine in cellule, tessuti e organi per circa l’87% dei geni codificanti proteine umane. Credito: Human Protein Atlas.
La cellula umana media contiene circa 10.000 proteine diverse. Esistenti in diverse o milioni di copie in ogni cellula, le proteine mediano ogni genere di compito, tra cui trasformazioni chimiche, comunicazione e traffico intracellulare. “Per svolgere queste funzioni cruciali, ogni proteina deve stringere amicizia con partner designati“, afferma Emma Lundberg, bioingegnere presso la Stanford University in California. “Se vuoi capire come funzionano le cellule, devi capire con quali proteine interagiscono e dove”.
Per coordinare la massa di parti in movimento, le cellule eucariotiche hanno sviluppato organelli legati alla membrana e altri compartimenti subcellulari che raccolgono reti proteiche in ambienti controllati, ognuno con una funzione distinta. Calcolando i siti in cui opera una proteina, i ricercatori possono dedurre qualcosa sul suo lavoro. “È come una persona in una casa: se sei in cucina o nella tua lavanderia, posso fare una buona ipotesi su cosa stai facendo”, afferma Lundberg.
Ma, come le persone, le proteine non sono limitate a un solo posto; come hanno scoperto ricercatori come Lundberg nel campo in rapida crescita della proteomica spaziale, più della metà delle nostre proteine ha più di un punto di ritrovo. Molte hanno più funzioni e svolgono ruoli diversi a seconda della loro posizione. Allo stesso modo, i processi cellulari vacillano quando le proteine si presentano nel posto sbagliato. “Ciò dimostra davvero che questa nozione di ‘un gene, una proteina, una funzione’ non è davvero corretta“, afferma Lundberg.
Con i progressi nell’imaging ad alta risoluzione, nella spettrometria di massa e nell’analisi dei dati assistita dall’apprendimento automatico, i ricercatori di proteomica spaziale stanno mappando e tracciando le proteine con dettagli sempre maggiori su più scale, dai compartimenti subcellulari ai tessuti. Il lavoro è impegnativo e richiede molti dati, ma i risultati hanno prodotto approfondimenti sulla biologia cellulare e sulla progressione delle malattie, per non parlare delle potenziali strategie terapeutiche.
Cartografia cellulare
La proteomica è per le proteine ciò che la trascrittomica è per l’RNA. Contando i messaggi basati sull’RNA che la cellula scrive per dirigere il suo macchinario di produzione proteica, i professionisti della trascrittomica sperano di dedurre cosa sta facendo la cellula. Ma il livello di espressione di una data trascrizione non corrisponde necessariamente all’abbondanza della sua proteina corrispondente. E le cellule spesso modificano le loro trascrizioni e modificano le proteine dopo la traduzione per creare varianti diverse, chiamate proteoforme.
Entra in gioco la proteomica, che fornisce dati concreti per spiegare come la “lista delle parti” delle possibili proteine nei nostri geni viene assemblata per costruire i tipi di cellule nel corpo. Mappando le abbondanze proteiche nelle loro posizioni fisiche, la proteomica spaziale evidenzia come quelle proteine (e cellule) sono organizzate nei tessuti. Ci sono due approcci di base: il metodo di imaging della microscopia a fluorescenza e la spettrometria di massa quantitativa. I metodi sono complementari e due progetti di atlante su larga scala dimostrano la potenza del loro utilizzo congiunto.
Un campione di tessuto viene preparato per l’imaging proteoforma altamente multiplexato. Credito: Lisa La Vallee
Nel 2017, Lundberg e i suoi collaboratori hanno utilizzato un mix di entrambi i metodi per costruire un atlante subcellulare di oltre 12.000 proteine in 22 tipi di cellule chiamato Cell Atlas, che fa parte del progetto Human Protein Atlas con sede in Svezia. Il team ha colorato una libreria di cellule con anticorpi marcati con fluorescenza per ogni proteina bersaglio insieme a marcatori per strutture notevoli, come il nucleo e i mitocondri. Questi punti di riferimento cellulari hanno aiutato i ricercatori ad assegnare ogni proteina a una o più delle 30 posizioni subcellulari, dai principali organelli a opzioni più esoteriche, come giunzioni cellulari e goccioline lipidiche.
“L’immunofluorescenza funziona bene quando i ricercatori sanno quali proteine stanno cercando e hanno anticorpi adatti che possono etichettarle”, afferma Kathryn Lilley, biochimica presso l’Università di Cambridge, Regno Unito. I metodi più recenti che combinano cicli ripetuti di colorazione e imaging, come la co-rilevazione tramite indicizzazione (CODEX) e l’estensione iterativa dello sbiancamento con multiplexity (IBEX), possono visualizzare decine o centinaia di proteine etichettate in un singolo campione. Ma anche questi metodi multiplexati trascurano la maggior parte del proteoma. “La spettrometria di massa può aiutare a completare il quadro“, afferma Lilley.
Lilley e i suoi colleghi hanno sviluppato una serie di tecniche basate sulla spettrometria di massa per la mappatura subcellulare, chiamate in senso lato “localizzazione delle proteine degli organelli mediante etichettatura isotopica” (LOPIT). Per convalidare le assegnazioni basate sulle immagini del Cell Atlas, i ricercatori hanno applicato una variante chiamata hyperLOPIT che funziona rompendo attentamente le cellule, separandone il contenuto attraverso un gradiente di densità e digerendo le proteine da ogni campione usando enzimi. Quindi, etichettano ogni campione con un diverso tag isotopico, li ricombinano e analizzano la miscela risultante usando la spettrometria di massa tandem, un approccio quantitativo che consente loro di identificare, quantificare e assegnare migliaia di proteine ai loro compartimenti subcellulari originali.
Il team ha utilizzato questi e altri metodi per dimostrare che più della metà delle proteine nelle cellule umane potrebbe essere trovata in più di una posizione, e un sottoinsieme potrebbe essere trovato in almeno tre. Circa un terzo delle proteine era presente in ogni tipo di cellula, il che suggerisce che hanno ruoli generici di “pulizia” che mantengono le nostre cellule in funzione.
Nel 2022, Manuel Leonetti del Chan Zuckerberg Biohub di San Francisco, California, in collaborazione con Matthias Mann del Max Planck Institute of Biochemistry di Monaco, Germania e i loro colleghi del progetto OpenCell, hanno generato una libreria di 1.310 linee di cellule renali embrionali umane, ciascuna delle quali ha fuso un tag proteico fluorescente codificato geneticamente con un diverso bersaglio proteico. Il team ha quindi utilizzato la microscopia a fluorescenza per annotare manualmente la distribuzione della proteina contrassegnata nelle cellule viventi di ciascun tipo e per addestrare un algoritmo di apprendimento automatico per svolgere gli stessi compiti. Allo stesso tempo, i tag codificati geneticamente hanno fornito un antigene con cui il team di Mann ha potuto eseguire esperimenti di spettrometria di massa accoppiata a immunoprecipitazione. Questi consentono ai ricercatori di afferrare una proteina e i suoi partner di interazione e quindi addestrare un secondo algoritmo di apprendimento automatico per costruire sistematicamente una “rete sociale” per queste proteine. Gli utenti possono esplorare la posizione di ciascuna proteina e i suoi associati noti sul portale web OpenCell.
Prendiamo, ad esempio, FAM241A, una proteina “orfana” dalla funzione precedentemente sconosciuta. Quando Leonetti e i suoi colleghi hanno esaminato le cellule ingegnerizzate per esprimere FAM241A con un tag fluorescente, l’hanno trovata nel reticolo endoplasmatico, un organello che, tra le altre cose, appone modifiche chimiche alle proteine. Da quelle istantanee, l’algoritmo di apprendimento automatico del progetto ha previsto che FAM241A potrebbe interagire con due enzimi della libreria OpenCell che aggiungono uno specifico tipo di molecola di zucchero alle proteine. Ulteriori indagini hanno confermato che FAM241A fa parte dello stesso percorso, rivelandone la funzione.
Molecole in movimento
Le cellule viventi sono dinamiche, costruiscono e distruggono incessantemente biomolecole e le spostano da una posizione all’altra. Descrizioni dettagliate di dove le proteine si radunano tipicamente, e di come si spostano da un posto all’altro, possono aiutare i ricercatori a comprendere il significato dei movimenti delle proteine quando le cellule sono stressate o durante una malattia.
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In uno studio, ad esempio, Lilley e i suoi colleghi hanno misurato come il proteoma delle cellule del cancro polmonare risponde alla radioterapia, un trattamento comune per questa malattia. Utilizzando un flusso di lavoro basato su LOPIT, il team ha misurato i proteomi delle cellule del cancro polmonare coltivate esposte ai raggi X e quelle dei controlli non trattati. “Delle diverse centinaia di proteine che differivano tra le due condizioni, la maggior parte cambiava in abbondanza o posizione, ma raramente in entrambe”, afferma Lilley. Concentrandosi su quelle proteine che sembravano migrare dopo l’esposizione alle radiazioni, i ricercatori hanno identificato diversi attori chiave in un percorso di morte cellulare dipendente dal ferro chiamato ferroptosi che potrebbe contribuire alla resistenza alla radioterapia in alcuni tumori.
“Sebbene il lavoro sia preliminare, il percorso è un potenziale bersaglio terapeutico”, afferma Lilley.
Fonte: Nature