In un recente studio pubblicato su Gene Therapy, i ricercatori utilizzano il sistema CRISPR-Cas9 per indurre la sintesi di dopamina (DA) nel cervello di un ratto modello per il morbo di Parkinson (MdP).
L’incidenza della malattia di Parkinson aumenta con l’età ed è la seconda malattia neurologica più comune. La malattia di Parkinson è causata dalla degenerazione dei neuroni dopaminergici nella substantia nigra pars compacta, che produce dopamina per regolare il controllo motorio.
L’approccio ottimale per la gestione del Parkinson prevede l’uso di Levodopa (L-DOPA), un precursore che facilita la formazione e la sostituzione di dopamina. È importante sottolineare che questo trattamento ha una durata limitata di efficacia, che in genere si estende su circa cinque anni.
Gli astrociti sono fondamentali per la risposta immunologica del cervello nel morbo di Parkinson, come dimostrato da modelli animali e indagini post mortem. La tirosina idrossilasi (Th) è un enzima presente negli astrociti che è cruciale per la produzione di dopamina. In precedenza, gli autori del presente studio hanno riferito che l’espressione di Th negli astrociti ha aumentato con successo la produzione di DA nello stratium dei modelli di PD sia di ratto che di primati non umani.
Brevi ripetizioni palindromiche raggruppate e regolarmente interspaziate associate a Cas (CRISPR-Cas), sono una nuova tecnologia che ha rivoluzionato la terapia genica. Il mediatore di attivazione sinergica (SAM) è un sistema CRISPR di seconda generazione che attiva l’espressione genica utilizzando Cas9 enzimaticamente inattivo (dCas9) e attivatori co-trascrizionali.
Il presente studio esamina gli effetti dell’attivazione genica endogena nella stimolazione della produzione di dopamina negli astrociti, seguita dall’impianto di queste cellule in un modello di ratto di Parkinson.
Questi risultati offrono un approccio terapeutico mirato che può aumentare il periodo di trattamento senza farmaci e può essere combinato con altre terapie nei casi avanzati di Parkinson.
A proposito dello studio
I ricercatori hanno analizzato il genoma del ratto per identificare potenziali sequenze di acido ribonucleico (sgRNA) che erano altamente specifiche e non si allineavano con altre aree del genoma del ratto. Ciò ha portato all’identificazione di 13 sgRNA per l’attivazione del gene Th.
I livelli di acido ribonucleico messaggero Th (mRNA) nelle cellule C6 trasfettate con gli sgRNA Th selezionati sono stati valutati utilizzando la reazione a catena della polimerasi in tempo reale (RT-PCR).
La chirurgia stereotassica della lesione con 6-idrossidopamina (6-OHDA) è un modello di ratto ampiamente utilizzato per studiare il PD. Qui, 6-OHDA viene iniettato direttamente nel fascio mediano del proencefalo (MFB), dove distrugge i neuroni della dopamina. I ratti di controllo sono stati sottoposti alla stessa procedura, ma sono stati iniettati con acido ascorbico allo 0,1% in soluzione salina.
I ratti 6-OHDA sono stati successivamente impiantati con 20.000 astrociti (AST) o espressione di astrociti Th (AST-TH) sia nella parte anteriore che in quella posteriore dello striato. Sia prima che dopo l’intervento chirurgico, i ratti sono stati sottoposti a diversi test comportamentali tra cui rotazioni indotte da anfetamine, cilindro e test di bilanciamento del raggio inclinato per determinare se l’impianto di astrociti migliorasse le caratteristiche comportamentali dei ratti emi-parksoniani.
Risultati dello studio
Dei tredici sgRNA identificati nell’analisi, i ricercatori hanno discusso i risultati dello sgRNA TH4, poiché ha raggiunto i livelli più alti di espressione della proteina Th. Entrambe le cellule C6 e AST-TH trasfettate con TH4 sgRNA rilasciavano costantemente dopamina nel mezzo di coltura, cosa che non è stato osservato nelle rispettive cellule non trasfettate. L’espressione di TH4 sgRNA è stata confermata anche mediante immunofluorescenza e analisi Western blot.
Gli studi comportamentali hanno rivelato che i ratti che hanno ricevuto astrociti primari hanno mostrato un comportamento circolare significativamente maggiore rispetto ai ratti che hanno ricevuto cellule AST-TH. Allo stesso modo, i ratti trattati con astrociti di controllo hanno mostrato differenze significative nell’asimmetria del posizionamento degli arti anteriori (FPA) nel test del cilindro rispetto ai ratti trapiantati con AST-TH.
Il test di bilanciamento del raggio inclinato, che viene utilizzato per misurare il controllo motorio e l’equilibrio, ha indicato che i ratti trapiantati con AST-TH hanno mostrato caratteristiche comportamentali simili ai ratti non parkinsoniani.
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L’analisi immunoistochimica del cervello di ratto ha indicato che le aree dello striato che erano state impiantate con AST-TH mostravano una maggiore espressione di DA, che è paragonabile alla mancanza di DA osservata nelle aree lesionate del cervello. Inoltre, il turnover di DA all’interno dei cervelli trapiantati con AST-TH è rimasto intatto, mentre lo striato trattato con astrociti di controllo non ha mostrato alcun turnover di DA. Questi risultati dimostrano che l’AST-TH migliora la velocità del metabolismo DA nel cervello.
Rispetto ai cervelli di ratto che sono stati iniettati con astrociti di controllo, quelli impiantati con AST-TH hanno mostrato co-localizzazione di Th e proteina acida fibrillare gliale (GFAP), l’ultima delle quali è un biomarcatore di neuroinfiammazione.
Fonte: Gene Therapy
