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Un nuovo rapporto pubblicato sul server di prestampa medRxiv nell’aprile 2020 rivela che il nuovo coronavirus SARS-CoV-2 mostra la presenza di nuove mutazioni acquisite in casi umani infetti, che aumentano significativamente la sua capacità di causare malattie nell’uomo.
Con l’attuale nuova pandemia da coronavirus SARS-CoV.-2 che ha già causato circa 2,47 milioni di infezioni e 170.000 morti, a partire dal 18 aprile 2020, l’attenzione dei ricercatori si è concentrata su ciò che provoca il tasso di mortalità relativamente elevato in questa popolazione. Attualmente, gli scienziati hanno trovato una serie di forme varianti del virus SARS-CoV-2, che causa la pandemia di COVID-19.
La maggior parte delle infezioni è asintomatica. Il virus può diffondersi durante questo periodo asintomatico, rendendo il contenimento una vera sfida, come dimostra l’attuale diffusione della malattia negli Stati Uniti e in molti paesi dell’Europa occidentale. Rimane anche praticabile e capace di infezione negli aerosol per ore e su superfici fino a 7 giorni.
Perché le mutazioni nel nuovo coronavirus SARS-CoV-2 sono importanti?
Il virus ottiene l’accesso alla cellula ospite attraverso la spike glycoprotein (S), che si lega alla molecola dell’enzima 2 di conversione dell’angiotensina (ACE2) per entrare nella cellula. Questa molecola recettoriale si trova su una varietà di tessuti, tra cui l’epitelio della cavità nasale, il polmone e epitelio gastrointestinale. Sette betacoronavirus causano malattie nell’uomo, con gravità variabile. La parte più variabile del genoma del betacoronavirus è la parte che codifica il dominio di legame del recettore della proteina S (RBD). Molteplici variazioni sono state rilevate anche all’interno del genoma SARS-CoV-2, molte delle quali comprendono l’aggiunta, la sostituzione o la delezione di singoli nucleotidi – questi sono chiamati varianti a singolo nucleotide (SNV).
L’attuale studio affronta la domanda: queste mutazioni sono importanti per quanto riguarda la patogenicità del virus? In altre parole, qualcuno di questi SNV rende la malattia virale più o meno grave, infettiva o entrambe? La risposta potrebbe decidere come vengono sviluppati i vaccini e nuovi farmaci per contrastare questa malattia.
Lo studio
I ricercatori hanno sequenziato i genomi di 11 isolati virali di SARS-CoV-2 da un Ospedale cinese di Hangzhou, in Cina che si trova oltre 750 chilometri ad est di Wuhan, dove ha avuto origine l’epidemia. Gli 11 campioni di pazienti sono stati raccolti nei primi giorni dell’epidemia di Wuhan, tra il 22 gennaio e il 4 febbraio 2020. Dieci persone avevano lavorato, viaggiato o avuto uno stretto contatto con gli abitanti di Wuhan. L’ultimo è stato un contatto di un caso confermato COVID-19.
I pazienti presentavano sintomi moderati o gravi, tre avevano fatto ricorso a un medico di base e uno aveva richiesto cure mediche intensive. Tutti guariti dalla malattia.
La piattaforma Novaseq 6000 è stata utilizzata per eseguire il sequenziamento super-profondo degli 11 isolati. Ciò ha mostrato la presenza di 1-5 mutazioni nelle sequenze di codifica degli isolati. C’erano anche popolazioni virali miste.
I ricercatori hanno mescolato gli 11 isolati con cellule coltivate e quindi hanno valutato la carica virale a 1, 2, 4, 8, 24 e 48 ore dopo, nonché gli effetti citopatici (CPE) a 48 e 72 ore dopo.
Che cosa ha mostrato lo studio sulle mutazioni?
Il sequenziamento ultra-profondo ha mostrato 33 mutazioni. Di questi, dieci erano in popolazioni miste. Diciannove sono state osservate per la prima volta rispetto all’elenco di oltre 1100 mutazioni memorizzate presso GISAID. Molte di queste erano mutazioni del fondatore: ognuna può essere ricondotta al virus originale che ha generato un folto gruppo di virus. Questi gruppi si trovano ora nei pazienti di tutto il mondo.
Una mutazione era stata precedentemente osservata solo in Australia, ma era stata osservata in 2 isolati da pazienti che avevano partecipato a una conferenza con pazienti di Wuhan. Un terzo partecipante ha mostrato una nuova mutazione, correlata all’altra, ma in una posizione diversa dello stesso codone. Un altro ha mostrato tre mutazioni consecutive in un singolo gene, introducendo due mutazioni a livello della proteina, nonché una quarta non consecutiva. Nel complesso, l’analisi di un piccolo numero di isolati ha prodotto mutazioni molto diverse.
Due delle mutazioni hanno prodotto le stesse mutazioni in posizioni diverse sullo stesso codone. Una è stata osservata in 5 isolati, suggerendo la sua presenza nelle prime fasi della pandemia e in molti residenti di Wuhan. C’era una mutazione a 3 nucleotidi in un paziente, che ha creato un ceppo virale molto potente, sia in termini di carica virale che di CPE. Questo paziente è rimasto positivo per il virus per 45 giorni.
I ricercatori hanno anche effettuato un test in vitro per valutare l’effetto delle mutazioni sugli isolati. Tutti gli isolati sono stati miscelati con cellule in coltura e i risultati sono stati osservati a 1, 2, 4, 8, 24 e 48 ore dopo. Il CPE è stato anche osservato a 48 e 72 ore dall’infezione.
Per rilevare direttamente il virus SARS-CoV-2, i ricercatori hanno eseguito specifici rtPCR diretti contro tre geni virali: i geni ORF1a, E e N. Tutti e tre i gruppi di rtPCR hanno mostrato risultati molto simili. La soglia del ciclo è stata utilizzata come misura della carica virale. Più basso è il Ct, maggiore è il carico.
In che modo le mutazioni hanno influenzato la patogenicità?
I ricercatori hanno riferito che tutti i campioni non hanno mostrato segni di replicazione virale a 1, 2 e 4 ore dall’infezione. La carica virale ha iniziato ad aumentare a 8 ore, per alcuni ceppi. Alcuni ceppi hanno mostrato un tasso di aumento molto più veloce di altri.
A 48 ore, la curva di carica virale si è appiattita, ad eccezione di due che avevano già raggiunto un plateau in precedenza, a 24 ore. La carica virale dei ceppi alle due estremità dello spettro differiva di quasi 270 volte. Ciò porta a variazioni statisticamente significative tra i ceppi che producono la massima e minima carica virale a 48 ore.
In altre parole, diversi isolati virali che trasportano mutazioni diverse hanno una carica virale significativamente diversa. L’effetto citopatico o i tassi di mortalità cellulare sono proporzionali alla carica virale.
Quanto è importante lo studio?
I ricercatori affermano che l’elevata incidenza di diversi tipi di mutazioni in un campione relativamente piccolo è dovuta ai tempi precoci di campionamento all’interno di un’area geografica limitata del caso indice a Wuhan. Alcune delle mutazioni forniscono evidenti benefici o svantaggi in circostanze specifiche. Ad esempio, alcune mutazioni si trovano molto comunemente nell’interfaccia della proteina S-ACE2. C’era una marcata differenza nella carica virale a 48 ore nelle cellule infettate da diversi ceppi virali, dimostrando che mutazioni diverse cambiano il potenziale replicativo del virus.
Lo studio mostra come il genotipo influenza il fenotipo nella maggior parte dei casi, con l’effetto in vitro che promette di rivelare come si comportano diversi ceppi virali quando acquisiscono mutazioni diverse. Infine, i ricercatori hanno notato che 3 degli isolati provenivano da campioni di feci, in contraddizione con un altro rapporto che indicava che un virus vitale non poteva essere isolato da tali campioni. Ciò mostra la capacità virale di replicarsi anche in questi campioni.
Lo studio conclude che “la sorveglianza virale dovrebbe essere eseguita anche a livello cellulare quando possibile” poiché le mutazioni che si verificano nelle popolazioni di pazienti influenzano la patogenicità del virus. Un altro suggerimento è l’identificazione di tutte le mutazioni del fondatore nei più grandi gruppi di virus che circolano nel mondo al momento, per trovare utili differenze nella patogenicità. Lo sviluppo di vaccini e farmaci dipenderà anche dal fatto che queste mutazioni influenzino l’efficacia terapeutica”.
