Focus sulla produzione in laboratorio di anticorpi e sul nuovo sistema Cyto-Mine®

Perché gli anticorpi terapeutici vengono tradizionalmente prodotti in vivo per la scoperta precoce del farmaco?

Tipicamente, vengono utilizzati modelli in vivo perché sono economici e relativamente veloci nel generare anticorpi candidati che possono essere testati. Introdotta da Köhler e Milstein nel 1975, la tradizionale tecnica dell’ibridoma murino inizia iniettando un antigene validato o noto nel modello animale, ad esempio i topi, che provoca una risposta immunitaria che genera nuovi anticorpi. Questi nuovi anticorpi possono quindi essere raccolti e completamente caratterizzati a valle per garantire che abbiano la funzione e le proprietà molecolari desiderate.

I progressi scientifici e tecnologici hanno ulteriormente migliorato gli studi in vivo. Più recentemente, i topi umanizzati sono stati immunizzati per esprimere le immunoglobuline umane, piuttosto che i geni degli anticorpi murini, il che migliora la loro traslazione a valle.

Perché gli scienziati si stanno allontanando dalla produzione di anticorpi da modelli animali?

I modelli animali continuano ad essere prevalenti, principalmente perché provati e testati nel settore con buoni risultati. Nonostante le sfide, la tecnologia dell’ibridoma è una piattaforma consolidata e l’umanizzazione dei modelli animali ha ulteriormente promosso questo metodo. La maggior parte delle terapie approvate dalla FDA sono state prodotte utilizzando piattaforme umanizzate. Tuttavia, i modelli animali roditori possono causare immunogenicità specifica dei roditori e le proteine ​​del modello animale possono rimanere in una fase successiva. In effetti, non tutti gli anticorpi prodotti in modelli animali umanizzati saranno interamente umani. Altre tecnologie, ad esempio, l’utilizzo dei fagi fornisce un’alternativa interessante in quanto non richiede modelli animali, hanno tempistiche più brevi e i ricercatori possono utilizzare una raccolta di anticorpi completamente umana. Queste raccolte possono essere abbastanza diverse e possono contenere diversi costrutti al loro interno, ad esempio anticorpi a dominio singolo. L’uso del sequenziamento di nuova generazione (NGS) nei fagi aiuta a caratterizzare i geni delle immunoglobuline da popolazioni numerose, che rappresentano meglio gli anticorpi umani naturali.

L’ utilizzo dei fagi non è privo di inconvenienti; poiché si tratta di un sistema procariotico piuttosto che di un mammifero, potrebbero esserci problemi di affinità e di altre proprietà di questa piattaforma in vitro.

Quali caratteristiche cercano gli scienziati quando analizzano intere popolazioni di cellule B che producono anticorpi?

Dopo aver immunizzato con successo un animale, viene raccolto un organo linfoide, ad esempio la milza. Questo viene elaborato e le cellule B vengono isolate. Le cellule B che producono anticorpi specifici dell’antigene che si legano all’antigene bersaglio devono quindi essere separate da quelle che si legano ad altri antigeni. Successivamente, viene testata la reattività all’antigene bersaglio per garantire che gli anticorpi selezionati si leghino specificamente all’antigene (piuttosto che a una gamma di antigeni) e che questa affinità e sensibilità siano al di sopra del livello richiesto. Una volta isolate le cellule B, gli scienziati selezioneranno le caratteristiche di legame, la reattività crociata e altro ancora.

Quali tecniche sono comunemente usate per schermare le cellule B per queste caratteristiche?

I team di ricerca generalmente usano la citometria a flusso per schermare direttamente le cellule B o più spesso producono ibridomi che vengono quindi sottoposti a screening.

La produzione di una popolazione di ibridoma richiede una reazione di fusione tra la cellula B e una cellula di mieloma cancerosa. Ciò consente alla cellula B di proliferare e sopravvivere indefinitamente in coltura, che è essenziale per salvaguardare potenziali cellule di interesse. Sfortunatamente, quando si creano ibridomi, l’intera popolazione di cellule B non può essere fusa; pertanto, solo una parte della popolazione totale può essere vagliata, portando così alla perdita di gran parte del repertorio di cellule B.

Tradizionalmente, la citometria a flusso è preferita a causa della sua elevata produttività, e gli anticorpi secreti dalle cellule B possono essere potenzialmente schermati usando la cattura a freddo, una tecnica utilizzata per manipolare la cellula per impedire la secrezione completa di anticorpi intrappolandoli sulla superficie cellulare. Tuttavia, questa è una rappresentazione piuttosto che una misurazione diretta della secrezione di anticorpi.

Metodi di screening alternativi includono ELISA ed Elispot, che possono misurare la secrezione delle cellule B. Queste tecniche devono spesso essere svolte completate manualmente e questo limita lo screening a una scala ridotta.

Queste tecniche possono creare un ambiente difficile per cellule di alto valore. In che modo ciò influisce sulla vitalità cellulare e quindi sulla produttività?

Questo ciclo di processo, dall’immunizzazione del modello animale, alla raccolta di cellule e alla creazione di ibridomi o allo screening diretto delle cellule B, richiede in genere molto tempo. La popolazione di cellule bersaglio può raggiungere lo 0,001% dell’originale ~ 40 milioni di cellule nell’organo raccolto. Un’ulteriore perdita avviene a causa della diminuzione della vitalità cellulare e della morte cellulare a causa del duro trattamento di queste cellule può avere un grave impatto sulla produttività. Dopo aver completato questo ciclo, le cellule bersaglio potrebbero non essere trovate perché non sono state fuse con successo durante il processo di fusione dell’ibridoma o sono morte durante la coltura a causa della dura elaborazione. Questa è una grande sfida nel settore.

In che modo il sistema di analisi a singola cellula supera questi problemi?

Il sistema di analisi a singola cellula Cyto-Mine® può superare numerose sfide nel settore. Innanzitutto, la necessità di una tecnologia ad alto rendimento, ma delicata che permetta l’interrogazione profonda di interi repertori di cellule B e popolazioni di ibridoma preservando la vitalità cellulare. In secondo luogo, la necessità di analisi altamente sensibili e specifiche per trovare rare cellule che secernono anticorpi con le caratteristiche anticorpali desiderate.

 

Cyto-Mine® può essere utilizzato nello screening di popolazioni di cellule intere per trovare quella rara cellula B o ibridoma che secerne l’anticorpo specifico dell’antigene. In effetti, i ricercatori possono inserire cellule B isolate direttamente nel Cyto-Mine®, che riduce drasticamente le tempistiche del processo e rimuove la possibilità di perdere cellule in coltura. Inoltre, Cyto-Mine® offre la flessibilità nella progettazione del test, di cui vi è una grande necessità a causa della natura variabile degli obiettivi e dei prodotti biologici. Sostenuto dalla tecnologia picodroplet brevettata da Sphere Fluidics, Cyto-Mine® integra lo screening selettivo di decine di milioni di singole cellule in compartimenti acquosi miniaturizzati di picoliter chiamati picodroplets.

I picodroplet forniscono camere di micro-reazione individuali in cui si accumulano proteine ​​secrete e possono essere analizzate per identificare proteine ​​preziose (ad esempio anticorpi con specificità di antigene), per trovare rare cellule di interesse o per trovare cellule ad alta produzione.

I picodroplet stessi forniscono un ambiente protettivo per le fragili cellule B, proteggendole dallo stress da taglio mentre i picodroplet viaggiano attraverso i canali microfluidici. Le cellule possono anche essere incapsulate nei loro terreni di coltura preferiti, quindi non ci sono transizioni di coltura dannose.

Combinando l’isolamento delle cellule B e l’identificazione di “hit specifici dell’antigene” in un processo che richiede solo 1-2 giorni in Cyto-Mine®, riduce significativamente lo stress sulle cellule fragili e accelera i passaggi per l’analisi a valle come funzionale test o sequenziamento.

 Image credit: Sphere Fluidics

In che modo la tecnologia determina la specificità dell’antigene?

Gli utenti devono sapere se l’anticorpo è una IgG o una IgM, prima di effettuare sonde di rilevamento che si legheranno al target di interesse. Il formato del test si basa su una semplice reazione FRET e due sonde di rilevamento devono essere incapsulate nel picodroplet insieme alle cellule. Una che si lega alla regione Fc dell’anticorpo e un’ altra che bersaglia l’antigene su quell’anticorpo. Entrambe le sonde sono coniugate a un fluoroforo, creando una coppia di sonde di rilevamento che possono indurre una reazione FRET.

Quando le sonde di rilevamento sono nelle immediate vicinanze, cioè se si sono legate alle regioni Fc e Fab dell’anticorpo secreto, indurranno uno spostamento mediato da FRET sulla fluorescenza dove l’eccitazione di una sonda trasferirà energia all’altra che emetterà un segnale fluorescente. Cyto-Mine® rileva un trasferimento di energia all’interno del picodroplet e poiché le sonde di rilevamento sono personalizzate per indirizzare solo l’antigene di interesse, non ci sarà un trasferimento di energia fluorescente se l’antigene di interesse non è presente.

Cyto-Mine® supporta una progettazione flessibile del dosaggio, quindi il formato del dosaggio può essere personalizzato per renderlo specifico per il target.

L’automazione è stata importante nello sviluppo di questo sistema? Se è così, perché?

Sviluppato pensando al biopharma, il progetto iniziale di Cyto-Mine® si basava sul contributo di importanti aziende farmaceutiche, per risolvere le loro sfide più significative e l’automazione era vitale per farlo. L’attuale processo è incredibilmente lungo e noioso. Le nuove tecniche devono avere un’elevata produttività, diversità e flessibilità del dosaggio. Invece di automatizzare il pipettaggio, abbiamo creato un sistema completamente nuovo per affrontare la scoperta di anticorpi. Cyto-Mine® è applicabile anche allo sviluppo della linea cellulare, dove esiste una necessità analoga per automatizzare i processi inefficienti e Cyto-Mine® ha capacità di imaging e erogazione a cellula singola che lo rendono perfetto.

Come pensi che il processo di scoperta degli anticorpi si evolverà nel prossimo decennio? Che impatto avrà questo sull’industria farmaceutica e sulle terapie disponibili per i pazienti?

C’è un’incredibile richiesta di bioterapici a base di anticorpi ed è facile vedere quanto abbiano successo con oltre 500 terapie a base di anticorpi che iniziano a sperimentare clinicamente. Questa richiesta è esemplificata con uno dei 20 anticorpi della società anticorpale da tenere d’occhio nel 2020, un anticorpo contro il virus Ebola. La società che produce questo anticorpo potrebbe interrompere i test prima del completamento perché ha avuto un tale successo rispetto a qualsiasi altro trattamento.

Nel prossimo decennio, il processo di scoperta degli anticorpi deve diventare più rapido e, man mano che la nuova tecnologia viene incorporata, dovrebbe diventare più rapida. Questa ottimizzazione ridurrà i tempi di immissione sul mercato e porterà più rapidamente allo sviluppo di nuove terapie.

Fonte: NewsMedical